李柱來，張春玲，楊 州，朱文山，王 艱，許秀枝

喹喔啉是由苯環(huán)與吡嗪拼合而成的含氮雜環(huán)類化合物，喹喔啉環(huán)作為蝶啶和喹唑啉環(huán)的生物電子等排體，目前蝶啶和喹唑啉環(huán)最有代表性的藥物有甲氨蝶呤、曲美沙特、拓優(yōu)得等[1－2]。喹喔啉及其衍生物與ATP結(jié)構(gòu)中的堿基腺嘌呤互為電子等排體，而ATP是PTK催化各種蛋白酪氨酸激酶受體磷酸化的磷酸根供體。該類化合物通過拮抗酪氨酸激酶的活性，從而阻斷其磷酸化過程，使生物細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)過程不能正常進(jìn)行，從而影響細(xì)胞的增殖、遷移、分化，尤其是癌變細(xì)胞；此類化合物作為信號通路的阻斷劑，在抗腫瘤靶向新藥設(shè)計中備受關(guān)注。2000年至今已有十多個小分子酪氨酸激酶抑制劑類藥物上市用于腫瘤的靶向治療[3－4]。本研究利用生物電子等排體和拼合原理，通過O、S鍵的連接將喹喔啉環(huán)與吡啶、嘧啶等芳香雜環(huán)進(jìn)行拼合生成雙芳香環(huán)的新型化學(xué)實體（圖1），并采用 MTT法進(jìn)行初步體外抗腫瘤活性研究，以期開發(fā)出新一類特異性高、毒副作用小、耐受性好的新型抗腫瘤藥物。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器 集熱式磁力恒溫攪拌器（DF－1，金壇市江南儀器廠）；三用紫外線分析儀（ZF－I型，上海顧村電光儀器廠）；數(shù)字熔點儀（WRS－1B，上海精密科學(xué)儀器有限公司）；紅外光譜儀（Avatar 330 FT－IR，美國 Thermo Nicolet公司）；核磁共振儀（AVANCEⅢ，德國Bruker Biospin公司）?？鼓[瘤細(xì)胞增殖實驗所用儀器參照文獻(xiàn)[5]。

1.1.2 主要試劑 4－甲基鄰苯二胺、4－氯鄰苯二胺、4－羥基苯甲醛為阿拉丁分析純，草酸二乙酯為上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司分析純，三氯氧磷為北京鑫鼎騰飛技術(shù)發(fā)展有限公司分析純，3－羥基吡啶為南京誠杰化工有限公司分析純，2－巰基嘧啶、2－巰基－4，6－二甲氧基嘧啶為江蘇鴻泰化工有限公司分析純，2－巰基－4，6－二甲基嘧啶為金壇市合恩泰化工有限公司分析純，其余試劑均為國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司分析純；柱層析硅膠（青島海洋化工廠），未經(jīng)活化；TLC硅膠鋁板（德國 Merck KGaA 64271 Darmstadt公司）；腫瘤細(xì)胞株SGC－7901和HepG2由福建醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)研究所傳代培養(yǎng)?？鼓[瘤細(xì)胞增殖實驗所用試劑參照文獻(xiàn)[5]。

1.2 合成方法

1.2.1 2，3－二氯喹喔啉中間體的合成

1.2.1.1 6－氯喹喔啉－2，3－（1H，4H）－二酮（1c）和6－甲基喹喔啉－2，3－（1H，4H）－二酮（1m） 在250mL三口燒瓶中加入4－氯鄰苯二胺／4－甲基鄰苯二胺（0.133 3mol）、草酸二乙酯18.2mL（0.133 7mol）和4mol／L的HCl 100mL，磁力攪拌下、80℃水浴加熱回流反應(yīng)2h。反應(yīng)液冷卻至室溫，析出固體。抽濾，水洗，干燥得產(chǎn)物。1c：淺灰色固體，產(chǎn)率83.3%，mp＞300℃。IR（KBr，cm－1）：3 453（s），3 061（w），2 841（w），1 695（s），1 618（s），1 392（m），1 229（m），858（s）；1H－NMR（400MHz，CDCl3，δ）：11.93（d，2H），8.06（t，2H），7.64（d，1H）。1m：白色蓬松固體，產(chǎn)率89.6%，mp＞300℃。IR（KBr，cm－1）：3 472（s），2 854（w），1 697（s），1 534（s），1 394（m），1 136（s），807（s），691（w）；1H－NMR（400MHz，CDCl3，δ）：11.80（d，2H），7.03（d，2H），6.92（s，1H），2.50（t，3H）。

圖1 6－氯／甲基－2／3－芳基喹喔啉衍生物合成路線Fig 1 Synthetic of 6－chloro／methyl－2／3－arylquinoxaline derivatives

1.2.1.2 2，3，6－三氯喹喔啉（2c）和6－甲基－2，3－二氯喹喔啉（2m） 在250mL干燥三口燒瓶中加入化合物（1c）／（1m）（0.100 7mol）、POCl3120mL 和DMF 5～6mL，攪拌固體緩慢溶解，110℃加熱反應(yīng)2h。反應(yīng)液冷卻至室溫，將其慢慢倒入1 200mL冰水中，產(chǎn)生煙霧并急劇放熱，析出大量灰白色固體，靜置1h。抽濾，濾餅用水洗滌至中性，粗產(chǎn)物用乙醇／乙酸乙酯混合溶劑重結(jié)晶，活性炭脫色，析出白色沉淀，抽濾，干燥得產(chǎn)物。2c：白色固體，產(chǎn)率58.9%，mp 145.5～145.9℃。IR（KBr，cm－1）：1 598，1 469，1 283，1 249，1 159，1 008，888，832；1H－NMR （400MHz，CDCl3，δ）：8.05（q，1H），7.98（d，1H），7.76（d，1H）。2m：白色蓬松固體，產(chǎn)率80.0%，mp 114.4～114.9℃。IR（KBr，cm－1）：3 066（s），2 951（s），1 621（s），1 526（m），1 453（s），1 258（s），996（s），826（m）；1H－NMR（400MHz，CDCl3，δ）：7.92（d，1H），7.79（s，1H），7.65（d，1H），2.77（s，1H），2.61（s，1H），2.45（s，1H）。

1.2.2 6－氯／甲基－2／3－芳基喹喔啉衍生物的合成

1.2.2.1 4－（2，6－二 氯 喹 喔 啉－3－氧 基 ）苯 甲 醛（3c－1），4－（2，7－二氯喹喔啉－3－氧基）苯甲醛（3c－2），4－（2－氯－6－甲 基 喹 喔 啉－3－氧 基 ）苯 甲 醛 （3m－1）和4－（2－氯－7－甲基喹喔啉－3－氧基）苯甲醛（3m－2） 中間體（2c）／（2m）（0.004mol）、4－羥基苯甲醛0.488g（0.004mol），無水 K2CO30.556g（0.004mol）和20mL DMF，室溫攪拌反應(yīng)3～4h。將反應(yīng)液倒入冰水中，靜置，析出固體。抽濾，水洗濾餅，干燥，所得粗產(chǎn)物上柱，用乙酸乙酯／石油醚（1∶5）并逐漸增大極性進(jìn)行洗脫。3c－1：白色蓬松固體，產(chǎn)率42.0%，mp 175.7～175.9 ℃，IR（KBr，cm－1）：2 921（s），1 916（s），1 698（s），1 400（s），1 332（s），1 214（s），1 158（w），1 068（w），867（m）；1H－NMR（400MHz，CDCl3，δ）：10.09（s，1H），8.04（d，2H），7.95（d，1H），7.77（s，1H），7.63（d，1H），7.50（d，2H）。3c－2：乳白色固體，產(chǎn)率8.1%，mp 179.3～180.2℃，IR（KBr，cm－1）：2 819（w），2 352（w），1 700（w），1 573（s），1 445（m），1 328（s），1 211（s），1174（s），827（m）；1H－NMR（400MHz，CDCl3，δ）：10.09（s，1H），8.07（d，2H），7.75（s，1H），7.64（d，1H），7.51（t，3H）。3m－1：白色蓬松固體，產(chǎn)率69.0%，mp 136.2～142.2 ℃，IR（KBr，cm－1）：3 056（s），2 738（s），1 700（s），1 602（m），1 500（s），1 330（s），1 066（s），863（m），825（m）；1H－NMR（400MHz，CDCl3，δ）：10.01（s，H），8.05（d，2H），7.98（t，1H），7.51（m，4H），2.54（d，3H）。3m－2：乳白色固 體，產(chǎn) 率 6.9%，mp 189.3 ～190.6℃，IR（KBr，cm－1）：2 921（s），2 737（s），1 700（m），1 422（s），1 332（s），1 212（s），865（m），829（m）；1H－NMR（400MHz，CDCl3，δ）：10.08（s，1H），8.04（d，2H），7.56（m，4H），7.43（t，1H），2.51（s，3H）。

1.2.2.2 3－（吡啶－3－氧基）－2，6－二氯喹喔啉（4c－1），2－（吡啶－3－氧基）－3，6－二氯喹喔啉（4c－2）和6－甲基－3－（吡啶－3－氧基）－2－氯喹喔啉（4m－1） 合成方法同3c－1（2），用3－羥基吡啶代替4－羥基苯甲醛進(jìn)行反應(yīng)。4c－1：白色蓬松固體，產(chǎn)率41.3%，mp 151.3～151.6℃，IR（KBr，cm－1）：3 031（w），1 604（s），1 400（m），1 330（m），1 211（s），1 071（s），825（m），700（m）；1H－NMR（400MHz，CDCl3，δ）：8.67（s，1H），8.62（s，1H），7.97（d，1H），7.76（s，1H），7.70（d，1H），7.64（d，1H），7.48（s，1H）。4c－2：乳白色固體，產(chǎn)率7.6%，mp 157.5～159.6℃，IR（KBr，cm－1）：3 068（w），1 604（s），1 403（m），1 318（m），1 214（s），1 078（s），833（m），808（m）；1H－NMR（400MHz，CDCl3，δ）：8.69（s，1H），8.62（d，1H），8.02（s，1H），7.98（s，1H），7.67（d，1H），7.64（s，1H），7.49（d，1H）。4m－1：粗產(chǎn)物用乙醇重結(jié)晶，得乳白色晶體，產(chǎn)率53.1%，mp 131.4～132.7 ℃。IR（KBr，cm－1）：3 035（s），1 621（m），1 552（s），1 477（s），1 328（s），1 213（s），1 066（s），829（m），705（s）；1H－NMR（400MHz，CDCl3，δ）：8.68（s，2H），8.60（d，1H），7.91（d，1H），7.70（d，1H），7.55（m，2H），2.53（t，3H）。

1.2.2.3 3－（嘧啶－2－巰基）－2，6－二氯喹喔啉（5c－1），2－（嘧啶－2－巰基）－3，6－二氯喹喔啉（5c－2）和6－甲基－3－（嘧啶－2－巰基）－2－氯喹喔啉（5m－1） 合成方法同3c－1（2），用2－巰基嘧啶代替4－羥基苯甲醛進(jìn)行反應(yīng)。5c－1：白色晶體，產(chǎn)率 21.7%，mp 139.8～140.6℃。IR（KBr，cm－1）：2 923，1 604，1 554，1 380，1 125，1 008，921，836；1H－NMR（400MHz，CDCl3，δ）：8.63（d，2H），8.03（t，2H），7.77（d，1H），7.19（t，1H）。5c－2：淡黃色固體，產(chǎn)率6.5%，mp＞300 ℃，IR（KBr，cm－1）：2 922（w），1 596（s），1 557（s），1 384（m），1 125（s），1 000（s），921（s），832（m）；1H－NMR（400MHz，CDCl3，δ）：8.60（d，2H），8.06（s，2H），8.02（d，1H），7.17（t，H）。5m－1：粗產(chǎn)物用乙醇重結(jié)晶，得淺黃色晶體，產(chǎn)率35.4%，mp＞300 ℃。IR（KBr，cm－1）：3 056（s），1 621（m），1 553（s），1 380（s），1 122（s），1 000（s），830（m），744（m）；1H－NMR（400MHz，CDCl3，δ）：8.56（s，2H），7.97（dd，1H），7.84（s，1H），7.66（dd，1H），7.13（t，1H），2.62（s，3H）。

1.2.2.4 3－（4，6－二甲基嘧啶－2－巰基）－2，6－二氯喹喔啉（6c－1），2－（4，6－二甲基嘧啶－2－巰基）－3，6－二氯喹喔 啉 （6c－2）和 6－甲 基－3－（4，6－二 甲 基 嘧 啶－2－巰基）－2－氯喹喔啉（6m－1） 合成方法同3c－1（2），用4，6－二甲基－2－巰基嘧啶代替4－羥基苯甲醛進(jìn)行反應(yīng)。6c－1：紅色固體，產(chǎn)率34.5%，mp＞300 ℃，IR（KBr，cm－1）：3 033（w），1 642（s），1 583（m），1 261（s），1 124（s），1 008（s），923（s），836（m）；1H－NMR（400MHz，CDCl3，δ）：7.98（d，2H），7.73（d，1H），6.94（s，1H），2.44（s，6H）。6c－2：紅 色 固 體，產(chǎn) 率 9.2%，mp＞300 ℃，IR（KBr，cm－1）：3 033（w），1 693（m），1 585（s），1 243（s），1 149（s），1 122（s），1 012（s），927（s），836（m）；1H－NMR（400MHz，CDCl3，δ）：8.04（s，1H），7.98（d，1H），7.73（d，1H），6.89（s，1H），2.41（s，6H）。6m－1：粗產(chǎn)物用乙醇重結(jié)晶，得米白色晶體，產(chǎn)率36.2%，mp＞300℃。IR（KBr，cm－1）：3 027，2 921（s），1 740（m），1 619（s），1 583（s），1 244（s），1 127（s），998（s），829（m）；1H－NMR（400MHz，CDCl3，δ）：7.95（t，1H），7.82（s，1H），7.63（t，1H），6.86（d，1H），2.60（d，3H），2.38（d，6H）。

1.2.2.5 3－（4，6－二甲氧基嘧啶－2－巰基）－2，6－二氯喹喔啉（7c－1）和6－甲基－3－（4，6－二甲氧基嘧啶－2－巰基）－2－氯喹喔啉（7m－1） 合成方法同3c－1（2），用4，6－二甲氧基－2－巰基嘧啶代替4－羥基苯甲醛進(jìn)行反應(yīng)。粗產(chǎn)物用乙醇重結(jié)晶。7c－1：淺亮黃色晶體，產(chǎn)率 42.2%，mp 138.2～140.0 ℃。IR（KBr，cm－1）：2 988（w），1 754（s），1 589（m），1 374（s），1 268（s），1 189（s），923（s），830（m）；1H－NMR（400MHz，CDCl3，δ）：8.05（dd，2H），7.79（d，1H），5.85（s，1H），3.72（s，6H）。7m－1：白色晶體，產(chǎn)率52.8%，mp 148.9～152.4℃。IR（KBr，cm－1）：2 952（w），1 621（s），1 558（s），1 376（s），1 212（w），998（m），815（m）；1H－NMR（400MHz，CDCl3，δ）：7.94（m，2H），7.66（t，1H），5.80（s，1H），3.69（s，6H），2.62（d，3H）。

1.3 抗腫瘤活性 采用MTT法檢測15個6－氯／甲基－2／3－芳基喹喔啉衍生物（3c－1～7m－1）對SGC－7901及HepG2細(xì)胞株的體外細(xì)胞毒作用。人胃癌SGC－7901細(xì)胞和人肝癌HepG2細(xì)胞培養(yǎng)于10%胎牛血清 RPMI－l640的培養(yǎng)液中，并加入100U／mL鏈霉素和10μg／mL青霉素，在維持細(xì)胞分裂生長狀態(tài)下，將細(xì)胞接種在25mL的培養(yǎng)瓶中，放在37℃、體積分?jǐn)?shù)為0.95的空氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3d換1次培養(yǎng)液，待瓶中細(xì)胞長滿以后，再進(jìn)行傳代凍存。收集對數(shù)期SGC－7901及HepG2細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，每孔加100μL，鋪板使待測SGC－7901及 HepG2細(xì)胞密度分別為每孔10 000，7 000個。

實驗分對照組和目標(biāo)化合物組。對照組10孔，每孔加培養(yǎng)液100μL；目標(biāo)化合物組加入7種不同濃度梯度的6－氯／甲基－2／3－芳基喹喔啉衍生物，每孔100μL，設(shè)3個復(fù)孔，同時設(shè)置調(diào)零孔。放置于體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2、37℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48h，倒置顯微鏡下觀察，每孔加入20μL MTT溶液，在37℃下繼續(xù)培養(yǎng)4h，終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)液，每孔加150μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解，在酶聯(lián)免疫檢測儀570nm處測量各孔的吸光度[6－7]。

2 結(jié) 果

2.1 合成經(jīng)環(huán)合、氯代、親核取代反應(yīng) 此次共合成15個新的6－氯／甲基－2／3－芳基喹喔啉衍生物。4－氯／甲基鄰苯二胺與草酸二乙酯縮合生成內(nèi)酰胺，產(chǎn)率比與草酸反應(yīng)高。4－氯／甲基鄰苯二胺與草酸二乙酯進(jìn)行環(huán)合生成的6－氯／甲基喹喔啉－2，3（1H，4H）－二酮（1c，1m），內(nèi)酰胺化合物（1c，1m）可以互變異構(gòu)為6－氯／甲基喹喔啉－2，3－二醇，該中間體易與三氯氧磷進(jìn)行氯代反應(yīng)生成2，3，6－三氯喹喔啉（2c）和2，3－二氯－6－甲基喹喔啉（2m）?；衔铮?c，2m）環(huán)上的氯原子是很好的離去基團(tuán)，受相鄰氯原子的影響使其活性增強(qiáng)，在室溫條件下可以和羥基（巰基）吡啶、嘧啶等進(jìn)行親核取代反應(yīng)。目標(biāo)產(chǎn)物的合成，以DMF為溶劑、無水K2CO3為縛酸劑，將吡啶、嘧啶等芳香雜環(huán)通過O、S與喹喔啉環(huán)相連，形成新的化合物。所得產(chǎn)物存在幾何異構(gòu)體，通過柱層析進(jìn)行分離，異構(gòu)體間極性差異小，用乙酸乙酯／石油醚（1∶9）才能得以較好的分離。

2.2 目標(biāo)化合物對SGC－7901和HepG2細(xì)胞株的體外抗腫瘤活性 喹喔啉類衍生物對癌細(xì)胞增殖抑制作 用 見 表 1。6－氯－2／3－芳 基 喹 喔 啉 衍 生 物 對SGC－7901和HepG2細(xì)胞增殖抑制作用多數(shù)大于6－甲基－2／3－芳基喹喔啉衍生物，6位上引入吸電子基團(tuán)可以增加該類化合物的抗腫瘤活性。6－氯／甲基－2／3－芳基喹喔啉衍生物對人胃癌SGC－7901細(xì)胞的抑制效果較人肝癌 HepG2細(xì)胞好，其中6－氯－2／3－芳基喹喔啉衍生物（5c－1）和6－甲基－2／3－芳基喹喔啉衍生物（7m－1）對SGC－7901細(xì)胞增殖抑制IC50值分別為2.02和0.001 6μg／mL。7m－1是4，6－二甲氧基嘧啶通過S原子與6－甲基喹喔啉環(huán)相連，嘧啶環(huán)上甲氧基有強(qiáng)的給電子能力，通過共軛效應(yīng)影響目標(biāo)化合物的電荷分布及空間形態(tài)，可能提高了目標(biāo)化合物與受體的親合能力，該化合物對腫瘤細(xì)胞的增殖抑制活性高，可作為進(jìn)一步研究開發(fā)的重點。

表1 目標(biāo)化合物對SGC－7901和HepG2細(xì)胞株的半數(shù)抑制濃度Tab 1 IC50of target compounds for SGC－7901and HepG2 cell lines μg／mL

3 討 論

合成得到15個6－氯／甲基－2／3－芳基喹喔啉衍生物。這2類化合物，對SGC－7901和HepG2腫瘤細(xì)胞抑制作用較強(qiáng)，6－氯－2／3－芳基喹喔啉衍生物抗腫瘤活性多數(shù)大于6－甲基－2／3－芳基喹喔啉衍生物，其中6－氯－2／3－芳基喹喔啉衍生物（5c－1）和6－甲基－2／3－芳基喹喔啉衍生物（7m－1）對SGC－7901腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性好，可以進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，以期開發(fā)毒副作用小、耐受性好的新型抗腫瘤藥物。

[1]Khier S，Deleuze－Masquéfa C，Moarbess G，etal.Pharmacology of EAPB0203，a novel imidazo[1，2－a]quinoxaline deriva－tive with anti－tumoral activity on melanoma[J].EurJPharm Sci，2010，39（1－3）：23－29.

[2]Marverti G，Ligabue A，Paglietti G，etal.Collateral sensitivity to novel thymidylate synthase inhibitors correlates with folate cycle enzymes impairment in cisplatin－resistant human ovarian cancer cells[J].EurJPharmacol，2009，615（1－3）：17－26.

[3]周冰瑩，安春娜，蒲小平.酪氨酸激酶抑制劑類新藥的研發(fā)現(xiàn)狀[J].中國新藥雜志，2011，20（17）：1661－1666.

[4]趙迎春，張前軍，盧永仲，等.小分子蛋白酪氨酸激酶抑制劑的合成研究進(jìn)展[J].化學(xué)研究，2014，25（4）：428－440.

[5]張春玲，許秀枝，王 艱，等.3－取代喹喔啉衍生物的合成及其抗腫瘤活性的研究[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報，2013，29（1）：25－28.

[6]湯為學(xué)，駱云鵬，王瑞雪.人實體瘤抗癌藥物敏感試驗 MTT法的建立[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，1992，17（2）：103－108.

[7]李 杰，劉玉琴.MTT法在腫瘤研究中的改良及應(yīng)用進(jìn)展

[J].中國腫瘤臨床，1998，25（4）：312－313.