王 鋒，陳 碩，王 瑋

2.美國德克薩斯州大學(xué) 圣安東尼奧健康科學(xué)中心牙學(xué)院發(fā)育牙科系，德克薩斯州 78229

成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子（osterix，Osx）是一種與骨形成及牙發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子[1－3]，近來研究表明，Osx可能為骨形成蛋白2（bone morphogenetic protein 2，BMP2）所介導(dǎo)的成牙本質(zhì)細(xì)胞分化過程中一個(gè)重要的信號(hào)分子，尋找與Osx相互作用的其他信號(hào)分子或蛋白質(zhì)因子對闡明BMP2介導(dǎo)成牙本質(zhì)細(xì)胞分化的分子機(jī)制具有重大意義。本研究旨在通過重組DNA技術(shù)，構(gòu)建原核表達(dá)載體pGEX6P1－Osx，并利用原核蛋白表達(dá)與純化技術(shù)獲得谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶（glutathione S－transferase，GST）－Osx融合蛋白，為后續(xù) GST pull－down實(shí)驗(yàn)篩選與Osx相互作用的蛋白質(zhì)提供充足的誘餌蛋白。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）細(xì)菌與載體：大腸桿菌 DH5α、BL21由本實(shí)驗(yàn)室保存；PCR－TopoII質(zhì)粒（美國Invitrogen公 司），pGEX6P 系 列 載 體 （美 國Amersham公司）。（2）主要試劑：Trizol Reagent、SuperScript?Ⅱ 逆轉(zhuǎn)錄酶、1kb plus DNA Ladder（美國Invitrogen公司）；REDTaq?DNA Polymerase（美國 Sigma公司）；QIAquick?PCR Purification Kit、QIAquick?Gel Extraction Kit、QIAGEN Plasmid Mini Kit（德國Qiagen公司）；LB培養(yǎng)基（美國Sigma公司）；限制性內(nèi)切酶EcoRI、XhoI（美國Invitrogen公司）；T4DNA連接酶（日本Takara公司）；氨芐青霉素（Amp）；以異丙基－β－D－硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）、谷胱甘肽瓊脂糖、還原型谷胱甘肽、考馬斯亮藍(lán) R250、SDS、Tris、溶菌酶（美國Sigma公司）；小鼠抗GST抗體、兔抗Osx抗體（美國Santa Cruz公司）。

1.2 方法

1.2.1 牙髓組織總RNA提取 取新生1～2d小鼠上、下頜磨牙，置研缽中，倒入少量液氮，迅速研磨；隨后加入1mL Trizol試劑，按Invitrogen公司操作說明以酚氯仿萃取總RNA。所得RNA樣品經(jīng)DNaseⅠ處理、Rneasy Mini Kit過柱純化后，以紫外分光光度計(jì)檢測RNA樣品濃度。

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 參照GeneBank中小鼠Osx核苷酸序列，利用Primer 5.0設(shè)計(jì)擴(kuò)增Osx mRNA全長片段的PCR引物，并在上、下游引物的5’端分別引入EcoRI與XhoI的酶切位點(diǎn)，引物序列分別為：

1.2.3 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈 取1μL（1μg）RNA模板，以O(shè)ligodT18為逆轉(zhuǎn)錄引物，按Invitrogen SuperScript?Ⅱ 逆轉(zhuǎn)錄酶操作說明逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈；總反應(yīng)體積20μL。

1.2.4 PCR擴(kuò)增目的基因Osx 取2μL cDNA模板，以Red Taq酶為DNA聚合酶，PCR擴(kuò)增目的基因Osx全長序列。PCR反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性4min；95℃變性30s→56℃退火45s→72℃延伸1min，循環(huán)35次；72℃持續(xù)延伸10min；4℃冷卻?？偡磻?yīng)體積為20μL。

1.2.5 PCR產(chǎn)物的TA克隆 按Invitrogen Topo TA Cloning Kit操作說明，配置4μL新鮮PCR產(chǎn)物（以QIAquick?PCR Purification Kit過柱純化）、1μL Salt Solution及1μL Topo Vector的Topo TA克隆反應(yīng)體系，室溫下孵育5min，置冰上冷卻；加2～4μL Topo克隆反應(yīng)產(chǎn)物至One Shot Chemically CompetentE.coli，輕觸管底混勻，冰上放置30min；42℃熱休克1min；迅速轉(zhuǎn)移至冰上冷卻2min；加入250μL SOC培養(yǎng)基，37 ℃，200r／min水平振蕩1h；取100μL轉(zhuǎn)化菌液涂板[Amp抗性LB平板，X－gal（＋），IPTG（＋）]，37 ℃過夜培養(yǎng)至藍(lán)白克隆形成；挑取白色陽性克隆菌落，擴(kuò)增培養(yǎng)后小提質(zhì)粒酶切鑒定并進(jìn)一步測序。

1.2.6 pGEX6P1－Osx 重 組 質(zhì) 粒 的 構(gòu) 建 以EcoRI、XhoI雙酶切PCR－TopoII－Osx克隆質(zhì)粒，切膠回收目的基因片段Osx；使用相同內(nèi)切酶使pGEX6P1表達(dá)載體線性化；按10∶1物質(zhì)的量比混合目的基因片段Osx與線性化pGEX6P1表達(dá)載體，以T4DNA Ligase為連接酶，配制10μL連接反應(yīng)體系，16℃連接過夜；取6μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)大腸桿菌，步驟同1.2.5；取100μL轉(zhuǎn)化菌液涂板，37℃過夜培養(yǎng)；挑取克隆菌落，擴(kuò)增培養(yǎng)并小提質(zhì)粒；酶切篩選陽性質(zhì)粒并測序鑒定。

1.2.7 Osx重組原核蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 取1μL測序鑒定正確之重組質(zhì)粒pGEX6P1－Osx，轉(zhuǎn)化至50μL大腸桿菌BL21，步驟同1.2.6；取少量菌液劃板培養(yǎng)至克隆形成，隨機(jī)挑取1個(gè)克隆，加入2mL LB培養(yǎng)基[Amp（＋），100μg／mL]，37℃、200r／min振蕩培養(yǎng)8h；吸取200μL菌液，按1∶100比例加入20mL LB培養(yǎng)基中繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)；至菌液吸光度值（OD600nm）達(dá)0.4～0.6后，加入終濃度為1mmol／L的IPTG，于16℃、100r／min分別誘導(dǎo)培養(yǎng)4，6，8，12h，并設(shè)立對照；各時(shí)間點(diǎn)采集各樣本菌液（1mL），離心，棄上清，加入等體積2×SDS Loading Buffer，100℃煮沸變性5min，至冰上冷卻；取15μL樣本行SDS－PAGE電泳；考馬斯亮藍(lán)染膠、脫色、干膠儀干膠。

1.2.8 Osx重組原核蛋白的純化 將重組質(zhì)粒pGEX6P1－Osx轉(zhuǎn)化至BL21，激活A(yù)mp抗性后取少量菌液劃板培養(yǎng)至克隆形成，隨機(jī)挑取單個(gè)克隆入LB培養(yǎng)基，37℃過夜振蕩培養(yǎng)；按1∶100體積比繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)，至菌液OD600nm達(dá)0.4～0.6，加入終濃度為1mmol／L的IPTG，16 ℃、100r／min培養(yǎng)4h。4℃離心，棄上清，以10mL Lysis Buffer（50mmol／L Tris－Hcl，5mmol／L EDTA，50mmol／L KCl，1mmol／L DTT，1mmol／L PMSF，0.1%Triton X－100，1mg／mL溶菌酶）裂解菌淀，冰上孵育30min；超聲破碎4min；離心（4 ℃，12 000r／min，15min）獲取上清（內(nèi)含可溶性外源蛋白），加入20mg谷胱甘肽瓊脂糖，4℃旋轉(zhuǎn)搖床孵育過夜；次日以緩沖液Ⅰ（50mmol／L Hepes緩沖液）洗滌結(jié)合GST－Osx融合蛋白的谷胱甘肽瓊脂糖凝膠，10min×3；最后以緩沖液Ⅱ（5mmol／L還原型谷胱甘肽）洗脫GST－Osx融合蛋白，取洗脫前及洗脫后的靶蛋白上清液各15μL煮沸變性后進(jìn)行SDSPAGE電泳；考馬斯亮藍(lán)染膠、脫色、干膠儀干膠。

1.2.9 Western－blot鑒定純化重組蛋白 將洗脫的靶蛋白上清液煮沸變性后進(jìn)行SDS－PAGE電泳，每孔上樣5μL；半干轉(zhuǎn)膜法（15V，2h）將靶蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜；5%脫脂奶粉室溫封閉30min；加一抗（兔抗Osx抗體，小鼠抗GST抗體），4℃孵育過夜；TBST充分洗膜；加HRP標(biāo)記的二抗（山羊抗兔IgG，山羊抗小鼠IgG）室溫孵育1h；TBST洗膜；加ECL孵育，暗室曝光、顯影、定影。

2 結(jié) 果

2.1 Osx基因的PCR擴(kuò)增 以牙髓組織總RNA逆轉(zhuǎn)錄生成的Osx cDNA第一鏈為模板，用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，擴(kuò)增出的片段約在1.3kb處形成單一的條帶（圖1），與預(yù)期片段大小一致。

圖1 Osx PCR電泳圖Fig 1 PCR amplication of the target gene

2.2 重組PCR－TopoII－Osx的鑒定 將目的基因PCR產(chǎn)物與T載體（PCR－TopoII）的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至 DH5α（one shot chemically competentE.coli），通過含50μg／mL Amp的LB平板藍(lán)白篩選陽性克隆，隨機(jī)挑取白色菌落擴(kuò)增培養(yǎng)并小提質(zhì)粒，以EcoRI、XhoI酶切鑒定。由于線性PCR－TopoII T載體的大小約為4kb，目的基因約1.3kb，重組質(zhì)粒的理論長度約為5.3kb，酶切獲得2條正確的目的條帶（圖2），表明重組質(zhì)粒連接轉(zhuǎn)化成功。將重組質(zhì)粒送UTHSCSA分子醫(yī)學(xué)檢測中心進(jìn)行測序，測序結(jié)果與已知序列比對完全吻合，證明重組PCRTopoII－Osx構(gòu)建成功。

圖2 TopoII－Osx酶切電泳圖Fig 2 Enzyme digestion of TopoII－Osx

2.3 重組pGEX6P1－Osx的鑒定 將表達(dá)質(zhì)粒pGEX6P1與鑒定正確的重組子PCR－TopoII－Osx同時(shí)以EcoRI、XhoI雙酶切后，分別對載體與目的基因片段進(jìn)行膠回收；各取5μL回收產(chǎn)物跑電泳檢測（圖3）；隨后將回收的載體與目的基因片段過夜連接并轉(zhuǎn)化至DH5α，進(jìn)而篩選陽性克隆并小提質(zhì)粒；以EcoRI或XhoI單酶切，可得到長約6kb的目的片段，與預(yù)期相符（目的基因理論長度1.3kb，pGEX6P1理論長度約4.9kb）；以EcoRI、XhoI進(jìn)行雙酶切，則可獲得大小分別約為4.9kb與1.3kb的2個(gè)片段（圖4）。測序結(jié)果與已知序列比對相吻合，證明重組pGEX6P1－Osx構(gòu)建成功。

圖3 膠回收DNA片段電泳圖Fig 3 DNA recycled from gel

2.4 Osx重組原核蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 含pGEX6P1－Osx的轉(zhuǎn)化菌BL21于16℃經(jīng)IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)4，6，8，12h后分別采樣進(jìn)行SDS－PAGE。重組菌泳道均可見增加一條約70kD的蛋白條帶，與融合蛋白的理論分子量吻合，但隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長蛋白表達(dá)量未見明顯增加，而作為對照的未誘導(dǎo)菌在此處則無誘導(dǎo)表達(dá)條帶（圖5）。

圖4 pGEX6P1－Osx雙酶切鑒定電泳圖Fig 4 Identification of recombinant plasmid by double enzyme digestion

圖5 原核表達(dá)產(chǎn)物SDS－PAGE電泳鑒定Fig 5 Identification of recombinant expressed protein by SDS－PAGE

2.5 Osx重組原核蛋白的純化 含pGEX6P1－Osx的轉(zhuǎn)化菌BL21置16℃冷房中以IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)4h，經(jīng)菌體裂解、超聲破碎后離心獲得可溶性總蛋白上清；因融合蛋白表達(dá)GST標(biāo)簽，故使用谷胱甘肽瓊脂糖樹脂特異性富集GST靶蛋白；洗脫后的靶蛋白經(jīng)SDS－PAGE電泳，大約在70kD處可見一單一蛋白表達(dá)條帶（圖6），此即純化的GST融合蛋白。

2.6 純化重組蛋白的鑒定 免疫印跡結(jié)果顯示，以GST標(biāo)簽抗體及Osx特異性抗體分別檢測純化的重組蛋白，均可見一大小約為70kD的陽性蛋白條帶（圖7），該條帶位置與GST－Osx的理論蛋白分子量吻合。

圖6 重組蛋白純化SDS－PAGE電泳鑒定Fig 6 Identification of purified recombinant protein by SDS－PAGE

圖7 Western－blot鑒定純化重組蛋白Fig 7 Identification of purified recombinant protein by Western－blot

3 討 論

Osx隸屬Sp／XKLF家族，主要表達(dá)于成骨細(xì)胞和成牙本質(zhì)細(xì)胞，是骨形成與牙發(fā)育過程中所必須的轉(zhuǎn)錄因子[1－3]。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，前成牙本質(zhì)細(xì)胞株iMDP3在BMP2刺激作用下，可促使Osx發(fā)生核轉(zhuǎn)位[4]，提示Osx可能為BMP2介導(dǎo)的信號(hào)通路的下游信號(hào)分子。BMP2條件性基因敲除后小鼠出現(xiàn)明顯異常的牙齒表型[5－6]，表明 BMP2在牙發(fā)育過程中具有不可或缺的作用。然而，BMP2經(jīng)由何種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控牙本質(zhì)發(fā)育的分子機(jī)制尚不明確；在BMP2介導(dǎo)的下游信號(hào)通路中，除Osx外，是否還存在能與其相互作用的其他信號(hào)分子亟待闡明。

GST pull－down實(shí)驗(yàn)是一個(gè)行之有效的驗(yàn)證酵母雙雜交系統(tǒng)的體外試驗(yàn)技術(shù)，其基本原理是將靶蛋白－GST融合蛋白親和固化在谷胱甘肽親和樹脂上，作為與目的蛋白親和的支撐物，充當(dāng)一種“誘餌蛋白”；當(dāng)目的蛋白溶液過柱時(shí)，可從中捕獲與之相互作用的“捕獲蛋白”（目的蛋白），洗脫結(jié)合物后通過SDS－PAGE電泳分析，從而證實(shí)2種蛋白間的相互作用或篩選相應(yīng)的目的蛋白[7－8]。本研究旨在通過重組DNA技術(shù)，構(gòu)建可表達(dá)GST－Osx融合蛋白的原核表達(dá)質(zhì)粒，通過蛋白純化技術(shù)，最終獲得攜帶GST標(biāo)簽的融合蛋白，為后續(xù)以GST pull－down實(shí)驗(yàn)篩選能與Osx相互作用的可能的信號(hào)分子提供充足的“誘餌蛋白”。

pGEX表達(dá)系統(tǒng)是一種可以高效表達(dá)GST融合蛋白的系統(tǒng)[9－10]，考慮 Osx基因序列與載體上匹配的酶切位點(diǎn)，本研究選用pGEX6P1作為原核表達(dá)載體，且宿主細(xì)胞為E.coliBL21，后者是常用的原核表達(dá)宿主菌，為蛋白酶缺陷株，可使表達(dá)的目的蛋白免于降解。此外，選擇PCR－TopoII－vector作為中間載體，主要考慮利用Topo克隆技術(shù)可高效快速連接線性載體和目的基因片段的特點(diǎn)，以此構(gòu)建PCR－TopoII－Osx克隆質(zhì)粒；盡管Topo克隆為非定向克隆，經(jīng)酶切鑒定插入片段大小正確的重組子尚不能排除反向連接的可能，但實(shí)驗(yàn)中筆者在PCR引物5’端及3’端已分別引入EcoRI及XhoI的酶切位點(diǎn)，故以EcoRI與XhoI酶切重組Topo克隆獲得的目的基因Osx，可定向克隆至經(jīng)相同酶切后回收的線性化載體pGEX6P1。定向克隆的重組子經(jīng)酶切電泳獲得與載體及插入片段大小一致的電泳條帶，證明重組原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX6P1－Osx構(gòu)建成功。

通過低溫培養(yǎng)和低速搖床來降低蛋白合成速度是有效提高E.coli表達(dá)系統(tǒng)重組蛋白可溶性的一個(gè)策略[9]，本研究發(fā)現(xiàn)，在溫度為16℃、搖床速度為100r／min的條件下，以1mmol／L的IPTG可有效誘導(dǎo)目的蛋白在宿主細(xì)胞BL21中表達(dá)，但進(jìn)一步增加誘導(dǎo)時(shí)間并不能明顯增加目的蛋白的產(chǎn)出，提示該目的蛋白的可溶性在誘導(dǎo)表達(dá)4h后已達(dá)最大值。

盡管SDS－PAGE電泳結(jié)果表明，利用谷胱甘肽瓊脂糖樹脂可成功富集特異性GST融合蛋白，但尚不能證實(shí)該融合蛋白即為GST－Osx；Western－blot結(jié)果顯示，特異性抗體與標(biāo)簽抗體的免疫反應(yīng)陽性條帶處于同一位置，且與理論蛋白分子量大小一致，證明該純化的融合蛋白為GST－Osx。

綜上所述，利用pGEX表達(dá)系統(tǒng)，可有效獲得GST－Osx融合蛋白，純化后的融合蛋白則可進(jìn)一步應(yīng)用于篩選成牙本質(zhì)細(xì)胞中潛在的能與Osx相互作用的其他未知蛋白質(zhì)與信號(hào)分子。

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