袁　超，趙　彤，敖育健，程　環(huán)

生物顯微鏡數(shù)字圖像白平衡的影響因素研究

袁超，趙彤，敖育健，程環(huán)

目的：研究生物顯微鏡數(shù)字圖像白平衡的影響因素及如何調(diào)整獲得最佳結(jié)果。方法：用色溫儀分別測(cè)量各因素作用時(shí)的數(shù)據(jù)及其之間的相互影響，用SASS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果：物鏡的使用可以增加色溫200～300 K，使用LBD濾色片可增加色溫值400～1 800 K，減小視場(chǎng)光闌90%可降低色溫約400 K，ND6濾光片、ND25濾光片、孔徑光闌對(duì)色溫?zé)o影響。結(jié)論：生物顯微鏡中各電學(xué)、光學(xué)元器件的參數(shù)要經(jīng)過(guò)科學(xué)的調(diào)整才能獲得數(shù)字圖像正確的白平衡。

顯微鏡數(shù)字圖像；白平衡；色溫；LBD濾色片；ND6/ND25濾光片

0　引言

影響顯微鏡數(shù)字圖像質(zhì)量的因素很多，如分辨率、清晰度、白平衡、對(duì)比度、像素、噪聲、動(dòng)態(tài)范圍等[1]。白平衡也可以稱(chēng)為色溫，色溫是表示光源光譜質(zhì)量最通用的指標(biāo)，可以通俗地認(rèn)為是表示光的顏色冷暖的物理參數(shù)。開(kāi)爾文認(rèn)為，假定某一純黑物體，能夠?qū)⒙湓谄渖系乃袩崃课斩鴽](méi)有損失，同時(shí)又能夠?qū)崃可傻哪芰咳恳浴肮狻钡男问结尫懦鰜?lái)，它產(chǎn)生輻射最大強(qiáng)度的波長(zhǎng)隨溫度變化而變化[2]。人眼對(duì)色溫是不敏感的，而電荷耦合器件（charge coupled device，CCD）則可真實(shí)記錄色溫，因此顯微鏡在數(shù)字成像時(shí)準(zhǔn)確控制色溫非常重要。影響顯微鏡圖像色溫的因素有鹵素?zé)襞蓦妷?、視?chǎng)光闌、孔徑光闌、LBD濾色片、ND6濾光片、ND25濾光片等。本文主要研究各種因素對(duì)色溫的影響以及怎樣組合才能獲得最準(zhǔn)確的色溫（5 500 K）。

1　材料與方法

1.1設(shè)備

Olympus BX53正置顯微鏡，配置12 V、100 W鹵素?zé)襞?，電?～12 V可調(diào)，配備有視場(chǎng)光闌、孔徑光闌、LBD濾色片、ND6和ND25濾光片、DP72制冷CCD、CELLSENCE圖像分析軟件及計(jì)算機(jī)硬件；柯尼卡美能達(dá)CL-500A色溫儀。

1.2標(biāo)本制備步驟

活體組織病理切片—石蠟包埋—蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色。

1.3測(cè)試方法與步驟

1.3.1驗(yàn)證不同物鏡對(duì)色溫的影響

方法：取出目鏡觀察筒中的目鏡，將色溫儀對(duì)準(zhǔn)觀察筒，使二者間沒(méi)有孔隙（如圖1所示）。選擇一個(gè)物鏡，點(diǎn)亮鹵素?zé)襞?，先后選擇1～12 V整數(shù)位共計(jì)12個(gè)電壓值，用色溫儀測(cè)量記錄不同電壓時(shí)的讀數(shù)，測(cè)量3次取其平均值記錄，然后更換不同物鏡，重復(fù)以上步驟。

圖1　驗(yàn)證不同物鏡對(duì)色溫的影響

2　結(jié)果與分析

2.1不同物鏡對(duì)色溫的影響

實(shí)驗(yàn)測(cè)得的數(shù)據(jù)見(jiàn)表1，編寫(xiě)并運(yùn)行SASS程序，得到統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果顯示，用和不用物鏡結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，100×物鏡與其他物鏡結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。但在實(shí)際測(cè)量中，光透過(guò)100×物鏡后變得很弱，色溫儀測(cè)量時(shí)間顯著延長(zhǎng)，從而使測(cè)量結(jié)果出現(xiàn)一定程度的偏差。除100×物鏡外，光經(jīng)過(guò)物鏡后色溫增加約200～300 K（如圖3所示），圖中系列1～6分別為無(wú)物鏡、4×物鏡、10×物鏡、20×物鏡、40×物鏡、100×物鏡時(shí)測(cè)得的色溫值隨電壓變化曲線。

表1　不同物鏡下實(shí)驗(yàn)測(cè)得的色溫值

表2　物鏡對(duì)色溫的影響結(jié)果

圖3　不同物鏡對(duì)色溫的影響曲線

2.2電學(xué)、光學(xué)元器件對(duì)色溫的影響

測(cè)得的數(shù)據(jù)制成表3，編寫(xiě)并運(yùn)行SASS程序，得到統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果顯示，用和不用LBD濾色片結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；視場(chǎng)光闌減少90%與各組結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；孔徑光闌、ND6濾光片、ND25濾光片對(duì)結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)影響。只使用鹵素?zé)襞荨⒉皇褂霉鈱W(xué)元器件時(shí)，色溫較低。電壓越低、色溫越低，電壓越高、色溫越高。LBD濾色片的使用對(duì)色溫值的改變具有顯著影響，使用該濾色片可大大增加色溫值，增加量為400～1 800 K。減小視場(chǎng)光闌90%對(duì)色溫有影響，可降低色溫約400 K。ND6濾光片、ND25濾光片、孔徑光闌對(duì)色溫?zé)o影響（如圖4所示）。圖中系列1～6分別為無(wú)濾色片和光闌、單LBD濾色片、90%單孔徑光闌、90%單視場(chǎng)光闌、單ND6濾光片以及單ND25濾光片時(shí)的色溫值隨電壓變化的曲線。

表3　不同電學(xué)、光學(xué)元器件下實(shí)驗(yàn)測(cè)得的色溫值K

表4　電學(xué)、光學(xué)元器件對(duì)色溫的影響結(jié)果

圖4　電學(xué)、光學(xué)元器件對(duì)色溫的影響曲線

3　討論

色溫對(duì)顯微鏡的圖像質(zhì)量有重要影響，主要表現(xiàn)在光源的色溫會(huì)影響到圖像色彩的還原[3]。在生物醫(yī)學(xué)中，通過(guò)多種染色技術(shù)使不同細(xì)胞、組織或細(xì)胞的不同成分具有不同的顏色，借此加以區(qū)分。如果色溫不準(zhǔn)確，就會(huì)使本來(lái)紅色的細(xì)胞質(zhì)顯示為紫色，本來(lái)藍(lán)色的細(xì)胞核顯示為黑色[4]。日常生活中，比如在路燈下面，衣服或者其他物體的顏色會(huì)顯得很不一樣，這就是光源色溫影響了大腦對(duì)于物體顏色的判斷，對(duì)于顯微鏡的CCD也會(huì)有同樣的問(wèn)題。人眼對(duì)顏色有自我適應(yīng)的功能，這使我們不管是在日光、熒光燈、鎢絲燈下看到的白色物體仍然是白色，只有在一些比較極端的情況下才會(huì)有偏差，而顯微鏡CCD的傳感器與此不同，會(huì)顯示物體的真實(shí)顏色色溫。調(diào)整白平衡的過(guò)程稱(chēng)為白平衡調(diào)整，白平衡調(diào)整的基本原理是對(duì)于低色溫的光源，其中的紅光占比例較高，我們就可以降低紅光的比例，提高藍(lán)光的比例，從而使各種顏色達(dá)到平衡，讓白色呈現(xiàn)出本來(lái)的白色。對(duì)于高色溫的光源也是類(lèi)似，通過(guò)降低藍(lán)光比例，提高紅光比例來(lái)達(dá)到調(diào)整白平衡的目的[5]。

LBD濾色片也叫做白平衡濾色片[6]，其作用類(lèi)似于藍(lán)色濾色片，可以將光路中一部分黃光濾掉，在燈泡電壓較低、光偏黃時(shí)作用有限，只有與適當(dāng)電壓相配合時(shí)才能將光濾成接近白色。ND濾光片也被稱(chēng)為中灰濾光片，其作用是降低光的強(qiáng)度而不改變光的顏色，ND6濾光片的作用是濾掉94%的光量而剩下6%的光強(qiáng)[7]。

通過(guò)對(duì)以上實(shí)驗(yàn)因素的分析總結(jié)得到數(shù)字圖像色溫偏低、圖像偏黃的原因有：未使用LBD濾色片；使用LBD濾色片、低倍鏡時(shí)未使用ND6/ND25濾光片，為使圖像不過(guò)亮過(guò)曝，燈泡電壓遠(yuǎn)不到12 V；使用LBD濾色片、低倍鏡時(shí)未使用ND6/ND25濾光片，為使圖像不過(guò)亮、過(guò)曝，嚴(yán)重縮小視場(chǎng)光闌。數(shù)字圖像色溫偏高、圖像偏黃藍(lán)的原因有：未使用LBD濾色片，為克服圖像偏黃，加了藍(lán)色濾色片；使用LBD濾色片，設(shè)置正確后又加了藍(lán)色濾色片；使用LBD濾色片、低倍鏡時(shí)，燈泡電壓給的太低，圖像偏黃，后加了藍(lán)色濾色片；使用LBD濾色片、低倍鏡時(shí)，嚴(yán)重縮小視場(chǎng)光闌圖像偏黃，后加了藍(lán)色濾光片。

綜合分析，為得到最準(zhǔn)確的白平衡和最佳圖像質(zhì)量，技術(shù)流程為：（1）將燈泡電壓置于12 V固定不變；（2）將LBD濾色片放置于光路中；（3）將視場(chǎng)光闌全部打開(kāi)；（4）選擇合適物鏡；（5）調(diào)整孔徑光闌，使其數(shù)值=物鏡數(shù)值孔徑（NA）值×80%[8]；（6）根據(jù)物鏡倍數(shù)大小，選擇ND濾光片組合：4×物鏡時(shí)選擇ND6+ND25濾光片；10×物鏡時(shí)選擇ND6濾光片；20×物鏡、40×物鏡時(shí)選擇ND25濾光片；100×物鏡時(shí)全不選。

[1]袁超，程環(huán).顯微鏡數(shù)字圖像的質(zhì)量控制[J].醫(yī)療衛(wèi)生裝備，2012，33（10）:100-103，120.

[2]葉永沛.色溫濾色片的設(shè)置與白平衡的校正運(yùn)用技術(shù)[J].電視制作，2014（3）:52-53.

[3]張數(shù)霖.近場(chǎng)光學(xué)顯微鏡及其應(yīng)用[M].北京:科學(xué)出版社，2000.

[4]宋菲君.近代光學(xué)信息處理[M].北京:北京大學(xué)出版社，1998.

[5]高寶昌.數(shù)碼相機(jī)的色溫和白平衡[J].照相機(jī)，2013（7）:29-33.

[6]李文忠.日本Olympus顯微鏡用的濾色片[J].北京生物醫(yī)學(xué)工程，1986（2）:57-59.

[7]紀(jì)孝陽(yáng).光電器件生產(chǎn)中光源色溫正確標(biāo)定的重要性[J].紅外技術(shù)，1984（5）:26-36.

[8]郭嘉泰.影響顯微鏡分辨率的幾種因素[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)物理學(xué)雜志，2013，20（4）:278-279.

（收稿：2014-05-16修回：2014-09-09）

（欄目責(zé)任編校:李影）

Factors affecting digital image white balance of biological microscope

YUAN Chao1,ZHAO Tong2,AO Yu-jian3,CHENG Huan1
(1.Experimental Instrument Plant,Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100850,China; 2.Institute of Basic Medical Sciences,Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100850,China; 3.Beijing Lead-color Technology Development Co.,Ltd.,Beijing 100390,China)

Objective To study the influencing factors of digital image white balance of the biological microscope and the way to obtain optimized image.Methods Color temperature meter was used to measure the influences of the factors and their correlations,and SASS software was employed for statistical analysis.Results Object lens might increase the color temperature by 200 to 300 K,LBD color filter could enhance it by 400 to 1 800 K.Reducing field stop by 90%might decrease color temperature by 400 K.ND6 filter,ND25 filter and aperture diaphragm had no influences on color temperature.Conclusion The electric and optical parameters of biological microscope have to be adjusted to gain proper white balance for digital image.[Chinese Medical Equipment Journal，2015，36（5）：95-97]

microscope digital image;white balance;color temperature;LBD color filter;ND6/ND25 filter

[中國(guó)圖書(shū)資料分類(lèi)號(hào)]R318.6；TH773A

1003-8868（2015）05-0095-03

10.7687/J.ISSN1003-8868.2015.05.095

袁超（1979—），男，工程師，主要從事醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)儀器計(jì)量、維修等方面的研究工作，E-mail:7book@163.com。

100850北京，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)儀器廠（袁超，程環(huán)）；100850北京，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所（趙彤）；100390北京，北京利凱樂(lè)科技發(fā)展有限公司（敖育健）

1.3.2驗(yàn)證各光學(xué)元器件對(duì)色溫的影響

方法：將色溫儀的測(cè)光口對(duì)準(zhǔn)顯微鏡聚光鏡的出光口，由于二者大小契合，可以不做密閉連接裝置（如圖2所示）。分別選擇什么都不使用，使用LBD濾色片、視場(chǎng)光闌、孔徑光闌、ND6濾光片、ND25濾光片，測(cè)試在1～12 V共計(jì)12個(gè)整數(shù)電壓值下色溫儀的讀數(shù)，測(cè)量3次取其平均值記錄。

圖2驗(yàn)證各光學(xué)元器件對(duì)色溫的影響