姬 娜 張 磊 熊 柳 孫慶杰

（青島農業(yè)大學食品科學與工程學院，青島 266109）

花生種皮原花青素結構的初步鑒定

姬 娜 張 磊 熊 柳 孫慶杰

（青島農業(yè)大學食品科學與工程學院，青島 266109）

本研究以脫脂花生種皮為原料，利用乙醇溶劑法進行粗提，得到花生種皮原花青素的粗提物。通過選用AB－8型大孔吸附樹脂純化花生種皮原花青素的粗提物得到3個級分，分別為20%乙醇純化物（PSPP1）、30%乙醇純化物（PSPP2）和50%乙醇純化物（PSPP3）。通過高效液相色譜－電噴霧質譜（HPLC／ESI－MS）分析可知，PSPP1檢測出2種單體、5種二聚體、7種三聚體和2種四聚體；PSPP2檢測出1種單體、4種二聚物、12種三聚物和5種四聚物；PSPP3檢測出1種單體、4種二聚物、7種三聚物和2種四聚物。該研究結果表明花生種皮組分中原花青素的組成較為復雜。通過質譜及碎片信息分析，可得出花生種皮原花青素的連接鍵類型主要包括 A型鍵［（C4－C8），（C2－O7），（C4－C6），（C2－O7）］和 B型鍵［（C4－C8）或（C4－C6）］。

花生種皮 原花青素 HPLC－MS

原花青素是自然界中普遍存在的聚多酚類混合物，具有較強的抗氧化、清除自由基能力，保護和穩(wěn)定維生素C，有助于維生素C的吸收［1］，是一種新型天然抗氧化劑，具有安全、無毒等優(yōu)點［2］，廣泛應用于癌癥、動脈硬化、腫瘤、毛細管疾?。?］等疾病的預防和治療，通常將二～四聚體稱為低聚體，將五聚體以上的稱為高聚體［4－5］。由于原花青素的保健功能與其臨床實驗的安全性，使原花青素在食品工業(yè)上得到非常廣泛的應用。作為抗氧化性食品添加劑，原花青素可作為食品增補劑、營養(yǎng)強化劑和天然抗氧化劑，還可以作為天然防腐劑來替代合成防腐劑，同時可以廣泛加入到各種普通食品如奶酪、蛋糕及酒和飲料中，作為健康食品的原花青素膠囊已成為美國天然植物十大暢銷品種之一［6］。目前，從自然界中分離鑒定的原花青素化合物共有200余種，主要集中在葡萄籽、葡萄皮、沙棘、蓮等植物中。樊金玲［7］對沙棘籽原花青素化合物進行了分離純化和結構鑒定，徐麗嫚［8］等對高粱外種皮中原花青素的組分進行了鑒定，而對花生種皮原花青素的結構研究較少，Appeldoorn等［9］主要對花生紅皮中的A－型二聚體進行了研究。花生是我國重要的油料作物與經濟作物，花生種皮作為花生加工的副產物，含有豐富的功能活性成分原花青素，具有較高的綜合利用價值。本研究采用大孔樹脂分離原花青素，用不同乙醇濃度洗脫得到了極性不同的原花青素，用HPLC－MS對純化的花生種皮原花青素組分和原花青素的結構單元進行分析和鑒定，為花生種皮中原花色素的綜合利用和工業(yè)化生產提供借鑒。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

脫脂花生種皮：青島東生集團股份有限公司；兒茶素、表兒茶素：Sigma公司。

1.2 試驗儀器

6430型三重四極桿液質譜聯(lián)用系統(tǒng)：美國安捷倫公司；Agilent ZORBAX Eclipse plus C18（2.1 mm×150 mm，1.8μm）色譜柱：美國安捷倫公司。

2 試驗方法

2.1 樣品的制備

稱取一定量60目的脫脂花生種皮，加入60%乙醇濃度溶液浸提，于水浴鍋中加熱回流提取2 h后，冷卻至室溫，在3 000 r／min下離心20 min，同法提取2次，合并提取液，50℃下進行真空濃縮后冷凍干燥，得到花生種皮原花青素粗提物，備用。稱取預處理過的 AB－8型大孔樹脂（交換容量不少于4.2 g／mol，含水量50%～60%，規(guī)格 HG－2－885－7 630 g），將濃度為2.5 mg／mL的原花青素提取液以流速0.5 mL／min流速通過樹脂柱至吸附飽和，水洗至洗脫液無色，分別用20%、30%、50%乙醇溶液分步洗脫，然后將所得到的分級洗脫級分分別為20%花生種皮原花青素乙醇純化物（PSPP1）、30%花生種皮原花青素乙醇純化物（PSPP2）、50%花生種皮原花青素乙醇純化物（PSPP3）真空濃縮，冷凍干燥后，備用。

2.2 各洗脫級分的高效液相色譜—質譜聯(lián)檢分析

將洗脫級分10 mg分別溶于10 mL純水中，經0.45μm濾膜過濾后進行HPLC－MS分析。

色譜條件：流動相：A－水，B－100%乙腈。按以下梯度進行洗脫：0～20 min，0～40%B；20～25 min，40%～41%B；25～35 min，41%B。柱溫：35℃，流速：1 mL／min，進樣量：20μL，檢測波長：280 nm。

質譜條件：ESI（－）；掃描范圍（m／z）：100～1 500；霧化氣溫度：350℃；霧化氣流速：9.0 L／min；霧化氣壓：30.0 psi；毛細管電壓：4 kV；錐孔電壓：－40.0 V；毛細管出口電壓：－135 V。

3 結果與分析

3.1 20%乙醇洗脫級分的HPLC－MS分析

AB－8型大孔樹脂純化的級分包括20%花生種皮原花青素乙醇純化物（PSPP1）、30%花生種皮原花青素乙醇純化物（PSPP2）、50%花生種皮原花青素乙醇純化物（PSPP3）。

PSPP1中原花青素成分的保留時間和質譜數(shù)據(jù)如表1所示，通過查閱國內外資料［10－12］，鑒定出了16種物質。原花青素單體主要由（＋）－兒茶素和（－）－表兒茶素組成，其相對分子質量為290，廣泛存在于葡萄籽、花生、山楂等多種植物中。原花青素單體還包括（－）－表兒茶素沒食子酸單酯、表沒食子酸兒茶素，其相對分子質量為442和306，這些單體相應的準分子離子［M－H］－m／z分別為：289，289，441，305。各單體通過C4－C6或C4－C8鍵相連，形成二聚體、三聚體、四聚體等。該試驗通過負離子模式檢測花生種皮原花青素單體和多聚體，由于花生種皮提取液中成分復雜，干擾較大，并且原花青素是通過黃酮類物質中的黃烷醇聚合而成，原花青素的各聚合體之間極性相近。因此，本試驗采用的液質條件只能較好地分離原花青素單體和二聚體、三聚體、四聚體等幾種。在PSPP1中檢測出的單體包括：在保留時間7.85 min檢測出負離子m／z289（表1），經標準品對照，確定為（－）－表兒茶素準分子離子；在保留時間為14.45 min時，檢測出負離子m／z441，沒有顯著的離子碎片出現(xiàn)，推測為（－）－表兒茶素沒食子酸單酯。

表1 PSPP1中原花青素成分的保留時間和質譜數(shù)據(jù)

對單體來說，二聚體的分離比較困難，其對應的質譜數(shù)據(jù)也較復雜，除推斷出準分子離子外，還提供了一系列碎片離子信息。從表 1中m／z577和m／z575的質譜數(shù)據(jù)可以得出，二聚體有5種，保留時間分別為 3.95、5.04、7.35、8.46和 10.74 min，其中保留時間為7.35 min的為B型二聚體，m／z577推斷為B型二聚體［13］，其余都為A型二聚體。A型二聚體和B型二聚體的分子結構如圖1所示［10］，質譜數(shù)據(jù)中未得出m／z729和m／z881的沒食子酸二聚體單酯和沒食子酸二聚體二酯的質譜信息，說明花生種皮中不存在沒食子酸二聚體單酯和沒食子酸二聚體二酯。

圖1 不同類型的原花青素二聚體

原花青素聚合體的碎裂方式主要包括黃烷醇間連接鍵的斷裂（QM）、逆狄爾斯－阿德爾（RAD）反應和雜環(huán)裂解（HRF）反應。HRF反應為二聚體失去1個m／z126的中性分子。RAD反應是黃烷醇C－環(huán)上發(fā)生斷裂，失去1個相對分子質量為152的中性的結構（C8H8O3）。經RAD重排產生的碎片離子為m／z425，形成的碎片還可能失去一分子H2O，形成碎片離子為m／z407，m／z577的ESI質譜圖中的m／z407證明了這一點。黃烷醇間斷裂（QM）有2種可能，一種是失去僅以C4鍵與其他單元相連頂部單元T－unit（TOP）中性碎片，形成m／z為［m／z288－H］的離子；另一種可能是失去以C6或C8鍵與其他單元相連的底部單元 B－unit（BASE），形成m／z為［m／z290－H］的碎片片斷，m／z577二級質譜圖中的m／z289為二聚體失去T－unit（TOP）形成的碎片。如圖1所示。

二聚體中連接鍵的確定通過核磁共振（NMR）能夠較好鑒定，但是這些二聚體可能因結構（連接鍵或立體形狀）的不同而出現(xiàn)在不同的保留時間，所以能夠被色譜所分開，與Appeldoorn等［9］研究從花生紅皮中分離A－型二聚體，色譜圖的分離出現(xiàn)了4個峰，其中包括1個A－型二聚體，1個B型二聚體的結果一致。經與劉亮［13］結果進行比對，可以得出m／z577為B型二聚體。斷裂方式如圖2所示。

圖2 原花青素二聚體的斷裂途徑［13］

m／z575斷裂方式可能包括：m／z289＋285（QM），m／z423＋407（RDA）和m／z449（HRF）。如質譜數(shù)據(jù)中的顯示的碎片：除了m／z574．9外，m／z285.0為二聚體失去B－unit（BASE）形成的碎片，m／z407.2為二聚體發(fā)生RDA反應形成的碎片，m／z449為二聚體失去m／z為126的中性分子后形成的碎片，說明m／z575為二聚體，其斷裂方式包括的3種斷裂形式，且由 Appeldoorn等［9］知m／z575是 A型二聚體。m／z573是一種未被鑒定的二聚體，其可能的斷裂方式如圖3所示，可能包括：m／z289＋285（QM），m／z421＋409（RDA）和m／z447（HRF）。m／z573質譜圖的主要離子碎片為m／z285和m／z447。說明斷裂方式包括QM和HRF反應，其斷裂方式如圖3所示［10］。

圖3 m／z573的二聚體選擇性離子質譜圖

4種A型二聚體的準分子離子為m／z575，根據(jù)文獻［13］所知，其為B型二聚體的同分異構體，其連接鍵包括（C4－C8，C2－O7）或（C4－C6，C2－O7），推測其應該為［表兒茶素－（C4－C8），（C2－O7）－兒茶素］或［表兒茶素 －（C4－C6），（C2－O7）－兒茶素］。

從三聚體質譜數(shù)據(jù)可知，在保留時間為4.81、8.85、9.36、9.86、10.09、10.93、11.18、13.32 min時，推斷它們?yōu)槿垠w，其m／z為865。從其三聚體的ESI負離子質譜數(shù)據(jù)分析：m／z865.2為其準分子離子峰，其斷裂可能之一是失去1個T－unit形成m／z577二聚體負離子碎片。色譜數(shù)據(jù)中未發(fā)現(xiàn)m／z1 017，說明其不存在酯型聚合體。根據(jù)文獻［14］可知其是一種只有B型鍵連接的三聚體，分子結構為原花青素三聚體（C1）［（E）C－B－（E）C－B－（E）C］，由質譜數(shù)據(jù)可以得出，它的分子離子和質譜碎片主要有m／z287.2、m／z575．1、m／z713．1、m／z695，這些級分可能在黃烷醇C－環(huán)上發(fā)生RAD反應，失去1個相對分子質量為152的中性結構（C8H8O3）。經RAD重排產生的碎片離子，形成的離子級分還可以進一步失去一分子H2O，這樣就會出現(xiàn)m／z425、m／z408碎片。研究發(fā)現(xiàn)［14］，三聚體原花青素的RAD，只產生m／z713，而沒有發(fā)現(xiàn)m／z425、m／z408碎片與質譜數(shù)據(jù)的結果一致。其可能是內部黃烷醇鍵以苯醌－亞甲基方式裂解，產生m／z287（［Mtop－3H］－，次甲基苯醌）和m／z289（［Mbase－H］－，黃烷－3－醇單體）碎片，后者比前者離子碎片多，而m／z865三聚體原花青素只檢測到m／z575（［Mtop－middle－3H］－）和m／z287，未檢測到m／z289。

從PSPP1的色譜數(shù)據(jù)可以得出另外2個三聚體m／z為 863和 861，保留時間在 8.85、9.36、9.86、10.09、10.93、11.18 min時的m／z為 863，其二級質譜圖包括m／z289、m／z411．1、m／z575、m／z693.1等準分子離子，其為一種A型鍵連接的三聚體。在保留時間13.32 min出現(xiàn)1個m／z861的選擇性離子峰，其二級質譜碎片包括m／z709。可推測這些級分是在黃烷醇C－環(huán)上發(fā)生RAD反應，失去1個相對分子質量為152的中性的結構（C8H8O3），形成m／z709的離子碎片。

原花青素的四聚體結構更為復雜，組成方式較多，只能進行初步的推斷，在保留時間9.17 min和12.57 min所出現(xiàn)的2個峰的質譜數(shù)據(jù)，分別是m／z1 151和m／z1 149，根據(jù) Appledoorn等［9］推斷其為原花青素的四聚體，當m／z1 151時，其二級質譜離子碎片為m／z411、574.9、862.8、999.3。未見檢測到m／z861和573，因此不能確定其準確的連接結構。當m／z1 149時，其二級質譜離子碎片主要為m／z575。

3.2 30%乙醇洗脫級分的HPLC－MS分析

PSPP2中原花青素成分的保留時間和質譜數(shù)據(jù)如表2所示，PSPP2共鑒定出1個單體、4個二聚物、12個三聚物、5個四聚物。除PSPP1的質譜數(shù)據(jù)所推斷的準分子離子：m／z289、m／z575、m／z577、m／z861、m／z863、m／z865、m／z149、m／z1 151外，在保留時間14.06min時出現(xiàn)了1個新的準分子離子峰為m／z859，其 ESI的質譜圖碎片包括：m／z447和m／z735，m／z447可能為m／z573的二聚體離子經過HRF反應失去1個m／z126的中性分子形成的，但是其不遵循RDA反應，其可能是A型原花青素三聚體，連接鍵為［（E）C→A→（E）C→B→山奈酚或毛地黃黃酮］。

3.3 50%乙醇洗脫級分的HPLC－MS分析

PSPP3中原花青素成分的保留時間和質譜數(shù)據(jù)如表3所示，PSPP3中共鑒定出1個單體、4個二聚物、7個三聚物、2個四聚物。

除PSPP1和PSPP1的質譜數(shù)據(jù)所推斷的準分子離子：m／z289、m／z575、m／z577、m／z859、m／z861、m／z863、m／z865、m／z1 149、m／z1 151外，在保留時間14.08 min時出現(xiàn)了1個新的準分子離子峰為m／z573，推斷其為原花青素二聚體，其ESI的質譜圖碎片包括：m／z447和m／z285，m／z447是m／z573的二聚體離子經過HRF反應失去1個m／z126的中性分子形成的，m／z285.0為二聚體失去 B－unit（BASE）形成的碎片。質譜數(shù)據(jù)中未發(fā)現(xiàn)m／z421的碎片，說明其未發(fā)生RDA反應。

對于花生種皮原花青素來說，原花青素的低聚體和高聚體有著各種可能的分裂方式，所以對于分裂方式的研究有著重要的意義?；ㄉN皮中的原花青素和葡萄籽中原花青素有著大體相同的成分，本研究對于高聚體的（DP＞4）研究，受現(xiàn)實條件的限制，未進行深入研究，高聚體的鑒定是原花青素鑒定的先進和前沿領域，同時聚合度的增加，裂解的方式也千變萬化，產生的離子碎片信息也更復雜。

表2 PSPP2中原花青素成分的保留時間和質譜數(shù)據(jù)

表3 PSPP3中原花青素成分的保留時間和質譜數(shù)據(jù)

4 結論

本試驗采用的HPLC－MS分析鑒定花生種皮不同聚合度的原花青素的基本組成，花生種皮原花青素的組成與葡萄籽顯著不同，不存在沒食子酸單酯及其聚合體，并且其為非酯性原花青素。原花青素具有極性差異，因此用不同乙醇濃度可以鑒定出原花青素的不同成分。PSPP1中共鑒定出2個單體、5個二聚物、7個三聚物、2個四聚物；PSPP2中共鑒定出1個單體、4個二聚物、12個三聚物、5個四聚物；PSPP3中共鑒定出1個單體、4個二聚物、7個三聚物、2個四聚物。包括2種單體、3種二聚體、4種三聚體、2種四聚體，連接鍵類型包括A型鍵［（C4－C8），（C2－O7）或（C4－C6），（C2－O7）］，B型鍵［（C4－C8）或（C4－C6）］。

［1］劇紅梅，曲梓怡，王召令，等.原花青素的抗氧化作用［J］.中國組織工程研究與臨床康復，2007，11（16）：3155－3157

［2］高羽，董志.原花青素的藥理學研究現(xiàn)狀［J］.中國中藥雜志，2009，34（6）：651－655

［3］趙巍，王軍，段長青，等.噴霧干燥法制備微膠囊化山葡萄籽油粉末油脂［J］.中國糧油學報，2009，24（12）：78－85

［4］張寒俊，王海波，習羽.改進香草醛法測定葡萄提取物種的原花青素［J］.中國釀造，2010，29（8）：147－149

［5］溫鋼，李立群，隋新.葡萄籽中低聚原花青素的提取研究［J］.中國釀造，2010，29（1）：111－112

［6］朱靖蓉.葡萄籽原花青素的分離提純及抗氧化性研究［D］.烏魯木齊：新疆農業(yè)大學，2007

［7］樊金玲.沙棘籽原花色素的研究［D］.無錫：江南大學，2006：55－61

［8］徐麗嫚，黃曼，涂世，等.高粱原花青素的ESI－MS分析及其低聚體的RP－HPLC－MS／MS法分離鑒定［J］.食品科學，2011，32（20）：221－225

［9］Appeldoorn M M，Vincken JP，Sanders M，et al.Combined normal－phase and reversed－phase liquid chromatography／ESI－MS as a tool to determine the molecular diversity of A－type procyanidins in peanut skins［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2009，57（14）：6007－6013

［10］Paul J Sarnoski.Separation and characterisation of proanthocyanidins in Virginia type peanut skins by LC-MSn［J］.Food Chemistry，2012，131：927－939

［11］Jerneja Jakopic.HPLC－MSidentification of phenols in hazelnut（Corylus avellana L.）kernels［J］.Food Chemistry，2011，124：1100－1106

［12］Maaike M Appeldoorn.Efficient isolation of major procyanidin A－type dimers from peanut skins and B－type dimers from grape seeds［J］.Food Chemistry，2009（117）：713－720

［13］劉亮.荔枝果皮多酚氧化酶內源底物的確定及其促褐變機制［D］.武漢：華中農業(yè)大學，2008：15－39

［14］Monagas M，Garrido I，Lebron－Aguilar R，et al.Almond（Prunus dulcis（Mill.）D.A.Webb）skins as a potential source of bioactive polyphenols［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2007，55（21）：8498-8507.

Preliminary Structure Identification of the Procyanidins in Peanut Skin

Ji Na Zhang Lei Xiong Liu Sun Qingjie

（College of Food Science＆Engineering，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109）

Procyanidins were extracted from the defatted peanut skin using ethyl alcohol as solvent.Eluent with 20%ethanol（PSPP1），30%ethanol（PSPP2）and 50%ethanol（PSPP3）of the procyanidin purified by AB－8 resin were analyzed with high－performance liquid chromatography－electrospray ionization－mass spectrometry（HPLC／ESI－MS）.The results of HPLC／ESI－MS showed that PSPP1 consisted of two monomers，five dimers，seven trimers and two tetramers，PSPP2 consisted of one monomers，four dimers，twelve trimers and five tetramers and PSPP3 consisted of one monomers，four dimers，seven trimers and two tetramers.This meant that the composition of the purified procyanidins were very complex.The connection linkages of the polymer mainly were A type［（C4－C8），（C2－O7）or（C4－C6），（C2－O7）］and B type［（C4－C8）or（C4－C6）］.

peanut skin，procyanidin，HPLC－MS

TS239

A

1003－0174（2015）04－0119－06

山東省科技發(fā)展計劃（2012GNC11306）

2013－12－09

姬娜，女，1987年出生，碩士，食品工程

孫慶杰，男，1970年出生，教授，糧食、油脂與蛋白質工程