金周筠 劉寶林

（上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院生物系統(tǒng)熱科學(xué)研究所，上海 200093）

小麥麩皮抗凍蛋白提取的關(guān)鍵因素及其優(yōu)化

金周筠 劉寶林

（上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院生物系統(tǒng)熱科學(xué)研究所，上海 200093）

研究小麥麩皮抗凍蛋白提取率偏低與熱滯活性（Thermal Hytersis Activity，THA）易破壞的問(wèn)題。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)與響應(yīng)面分析方法對(duì)液料比、緩沖液pH、緩沖液濃度、飽和硫酸銨濃度這4個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，建立響應(yīng)值（包括：蛋白提取率、THA）與各影響因素之間的回歸方程，得出最優(yōu)提取條件為液料比7.5∶1、緩沖液pH 7.8、緩沖液濃度29 mmol／L、飽和硫酸銨濃度100%，在此條件下蛋白提取率理論值為41.46%、THA 0.019 5℃；驗(yàn)證試驗(yàn)表明蛋白提取率為41.98%，THA為0.019℃，證明優(yōu)化結(jié)果是可靠的。

小麥麩皮抗凍蛋白 提取 響應(yīng)面分析 優(yōu)化

抗凍蛋白（Antifreeze Protein，AFP）是一種能夠抑制冰晶生長(zhǎng)和重結(jié)晶的蛋白，能非依數(shù)性地降低溶液的冰點(diǎn)而對(duì)其熔點(diǎn)影響很小，這種冰點(diǎn)與熔點(diǎn)之間的差異稱(chēng)為熱滯活性（Thermal Hysteresis Activity，THA），因此，抗凍蛋白又被稱(chēng)為熱滯蛋白?？箖龅鞍自隰~(yú)類(lèi)、昆蟲(chóng)、植物、微生物等中均有分布，各來(lái)源的抗凍蛋白已成功運(yùn)用于食品、生物、農(nóng)業(yè)等方面，具有廣闊的應(yīng)用前景［1－2］。

2.2 兩組體格參數(shù)及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較 結(jié)果(表1)表明：隨訪前，與非進(jìn)展組相比，進(jìn)展組BMI、腰圍、WHtR、WHR較大，ALT、AST、UA、TG較高，BUN、Scr、HDL-C較低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。進(jìn)展組隨訪時(shí)間[(3.62±1.79)年]長(zhǎng)于非進(jìn)展組[(3.11±1.81)年，P<0.05]。隨訪結(jié)束時(shí)，兩組間上述指標(biāo)差異與隨訪前一致(P<0.05)；隨訪結(jié)束時(shí)，進(jìn)展組FBG、HB、FT3高于非進(jìn)展組(P<0.05)。

1992年，Griffith等［3］提出獲得植物內(nèi)源抗凍蛋白，從經(jīng)低溫鍛煉的能夠忍受細(xì)胞外結(jié)冰的冬黑麥葉片質(zhì)外體中純化了該蛋白。目前，多種植物抗凍蛋白已被分離純化和表征，包括冬黑麥（SecalecerealeL.）、胡蘿卜（Daucus carota）、冬小麥（Triticum aestivum）、沙冬青（Ammopiptanthus mongolicus）等［4］。我國(guó)作為小麥生產(chǎn)大國(guó)，每年僅小麥加工副產(chǎn)物——小麥麩皮的產(chǎn)量即達(dá)2 000萬(wàn)t以上，成本低廉，且安全性高；若從中提取出高活性的抗凍蛋白，將是豐富的可利用資源［5］。

根據(jù)以上課程，哲學(xué)要講授心理學(xué)、道義學(xué)(倫理學(xué))、論理學(xué)、純正哲學(xué)，不包含“印度及中國(guó)哲學(xué)”(東洋哲學(xué))。由后續(xù)情況看，哲學(xué)科因1881(明治14)年的改正而獨(dú)立后，開(kāi)始講授新設(shè)科目“印度及中國(guó)哲學(xué)”(東洋哲學(xué))。

目前，抗凍蛋白提取最主要的問(wèn)題是蛋白提取率偏低與熱滯活性易破壞的問(wèn)題，如夏露等［6］在pH 8.0，提取時(shí)間3 h，液料比5∶1，條件下獲得的冬麥粗提抗凍蛋白提取率為30%，THA為0.016℃。金濤等［7］用真空滲透離心法提取燕麥抗凍蛋白，在50 mmol／L PBS，0.35 MPa真空度下，真空 1 h得率僅為0.085 mg／g。在預(yù)試驗(yàn)階段，參考前人提取條件［8］，在液料比 5∶1、緩沖液 pH 8.0、緩沖液濃度 20 mmol／L、提取時(shí)間4 h、飽和硫酸銨濃度100%時(shí)，提取率僅為31.23%，THA為0.017 5℃。一般認(rèn)為，其影響因素主要包括液料、緩沖液濃度、提取時(shí)間及飽和硫酸銨濃度等，這些因素對(duì)以上2個(gè)指標(biāo)的影響或協(xié)同或拮抗。在參考米糠蛋白、燕麥蛋白的提取工藝的基礎(chǔ)上［9－11］，本試驗(yàn)采用響應(yīng)面法優(yōu)化抗凍蛋白的提取工藝參數(shù)，保證其熱滯活性不受損傷，為小麥副產(chǎn)物綜合利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥麩皮由上海市崇明縣堡鎮(zhèn)小漾村提供。

標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子質(zhì)量Marker：碧云天生物技術(shù)研究所。

無(wú)機(jī)錨固膠：采用NK尼高無(wú)機(jī)錨固膠，相關(guān)安全性能指標(biāo)和工藝性能標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)符合GB 50728—2011《工程結(jié)構(gòu)加固材料安全性鑒定技術(shù)規(guī)范》第4.2節(jié)和第4.8節(jié)中Ⅰ類(lèi)A級(jí)膠的規(guī)定，相關(guān)技術(shù)要求應(yīng)符合JGJ/T 271—2012《混凝土結(jié)構(gòu)工程無(wú)機(jī)材料后錨固技術(shù)規(guī)程》的相關(guān)規(guī)定。

2.1.3 緩沖液pH對(duì)蛋白質(zhì)提取率及THA的影響

1.2 儀器與設(shè)備

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，使用Design Expert軟件對(duì)液料比、緩沖液pH值、緩沖液濃度、飽和硫酸銨濃度4個(gè)因素分別在3個(gè)水平上進(jìn)行中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，考察的指標(biāo)為蛋白提取率與THA。共有29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中包括16個(gè)析因點(diǎn)，5個(gè)中心點(diǎn)和8軸向點(diǎn)。軸向點(diǎn)代表了每個(gè)獨(dú)立變量的極值水平；中心點(diǎn)代表中心水平，重復(fù)7次以估計(jì)試驗(yàn)誤差。響應(yīng)面分析因素與水平見(jiàn)表1，結(jié)果見(jiàn)表2。

1.3 方法

1.3.1 小麥麩皮的預(yù)處理

當(dāng)然，臘味飯中最有年味的做法，當(dāng)屬臘味八寶飯。八寶飯多是甜味糯米飯，所謂八寶指的是杏仁、梅子、葡萄干之類(lèi)的甜食。然而，咸味的臘味八寶飯，更能勾人食欲。八寶并不一定是八種食材，只是取其豐盛吉祥之意。臘味八寶飯主要采用干貨雜糧，寓意是五谷豐登，團(tuán)圓富貴。

1.3.2 蛋白質(zhì)提取率的計(jì)算

采用考馬斯亮藍(lán)比色法測(cè)定蛋白提取液中蛋白含量。

1.3.3 蛋白質(zhì)提取工藝的研究

將20 g小麥麩皮置于燒杯中，加入一定比例、一定濃度的緩沖液，不停攪拌，在預(yù)設(shè)定提取時(shí)間結(jié)束后，離心分離，收集上清液，將上清液用不同濃度的飽和硫酸銨進(jìn)行沉淀，沉淀在蒸餾水中復(fù)溶，用截流相對(duì)分子質(zhì)量6 ku的透析膜對(duì)純水透析12 h，濃縮、凍干，獲得粗提物，并采用DSC法檢測(cè)其THA。

1.3.4 DSC法測(cè)定樣品的熱滯活性

參照陳廷超等［12］的方法稍作改動(dòng)。將10μg樣品密封于鋁制坩堝中，放置在樣品池中央，降溫至－30℃，然后升溫至25℃，再降溫至－30℃。接著，緩慢升溫至樣品體系為固液混合物狀態(tài)，稱(chēng)為保留溫度（Th），停留2 min，再將溫度從Th降低至－30℃，重復(fù)上述過(guò)程，在不同的Th下停留2 min。記錄不同Th下，樣品結(jié)晶的起始溫度（T0），上述過(guò)程中升降溫的速率均為1.0℃／min。THA參照如下公式：

1.3.5 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的測(cè)定

電泳參照LaemmLi的不連續(xù)系統(tǒng)，并稍作改進(jìn)，使用4%和15%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的濃縮膠和分離膠。

古董市場(chǎng)里不光商品琳瑯滿目，而且各家店鋪的老板更是些狠角色，王祥還沒(méi)來(lái)得及開(kāi)口問(wèn)自己的東西怎么賣(mài)，就差點(diǎn)被人忽悠著買(mǎi)下一個(gè)“光緒帝用過(guò)的犀角杯”，幸好他沒(méi)這個(gè)閑錢(qián)。打這之后，王祥就不敢再找這些老板們做生意了，不過(guò)這趟也沒(méi)白來(lái)，王祥最終在古玩市場(chǎng)外找到了自己的“歸宿”——擺地?cái)偂?/p>

1.3.6 蛋白的分離純化

粗提抗凍蛋白按照陽(yáng)離子交換色譜、凝膠過(guò)濾色譜和高效液相色譜這3個(gè)步驟純化，對(duì)活性組分透析后凍干。

在采用20 mmol／L緩沖液、液料比6∶1、提取時(shí)間4 h、80%飽和硫酸銨條件下，研究緩沖液不同pH對(duì)蛋白質(zhì)提取率及THA的影響。由圖3可知，隨著緩沖液pH的升高，提取率逐漸增大。受緩沖液性質(zhì)的影響，其pH不宜高于8.0；且高pH易使目標(biāo)蛋白發(fā)生變性，因此未考慮進(jìn)一步提高pH已獲得更高的蛋白提取率。同時(shí)，由圖3可知，隨著pH的升高，THA也逐漸增大。因此，可以推斷，緩沖液pH對(duì)蛋白提取率及THA有較大影響。

分別試驗(yàn)研究液料比、提取時(shí)間、緩沖液pH值、緩沖液濃度以及飽和硫酸銨濃度對(duì)小麥麩皮抗凍蛋白提取率的影響。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)的自變量及水平，以蛋白提取率與THA兩個(gè)指標(biāo)為響應(yīng)值，通過(guò)響應(yīng)面分析（RSA）方法進(jìn)行數(shù)據(jù)的回歸分析及顯著性檢驗(yàn)，以確定提取最優(yōu)工藝條件。每個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)重復(fù)2次，結(jié)果取平均值。數(shù)據(jù)處理過(guò)程中各自變量的水平轉(zhuǎn)換為無(wú)因次代碼表示：

式中：xi為自變量的代碼值；Xi為自變量的真實(shí)值；X0為自變量中心水平處真實(shí)值；ΔXi為步長(zhǎng)。數(shù)據(jù)處理采用Design Expert軟件，將試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次方程回歸擬合得到各次項(xiàng)系數(shù)。在RSA給出的最優(yōu)條件下通過(guò)試驗(yàn)證明預(yù)測(cè)的可靠性。

對(duì)以上兩模型分別進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表3所示。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 液料比對(duì)蛋白質(zhì)提取率及THA的影響

在采用20 mmol／L PBS緩沖液（pH 7.4）、提取時(shí)間4 h、80%飽和硫酸銨條件下，研究不同液料比對(duì)蛋白質(zhì)提取率及THA的影響。由圖1可知，在液料比4∶1時(shí)，蛋白質(zhì)的提取率比較低，僅為23%左右，隨著液料比的上升，蛋白質(zhì)的提取率不斷上升，在液料比6∶1～8∶1之間時(shí)，提取率趨于最大，進(jìn)一步增加液料比對(duì)提取率影響不大。出于節(jié)能的考慮，將中心點(diǎn)定在液料比7∶1左右。同時(shí)，由圖1可知，液料比對(duì)THA無(wú)明顯影響。

圖1 液料比對(duì)小麥麩皮提取率及THA的影響

2.1.2 提取時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取率及THA的影響

在采用20 mmol／L PBS緩沖液（pH 7.4）、液料比6∶1、80%飽和硫酸銨條件下，研究不同提取時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取率及THA的影響。由圖2可知，提取時(shí)間對(duì)提取率無(wú)明顯影響，提取4 h與提取2 h相比，提取率僅提高了2個(gè)百分點(diǎn)左右，因此基本可認(rèn)為提取時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)的提取率不是關(guān)鍵因素。同時(shí)，由圖2可知，提取時(shí)間對(duì)THA無(wú)明顯影響。

圖2 提取時(shí)間對(duì)小麥麩皮提取率及THA的影響

GNSS RTK在低收入農(nóng)村科技幫扶工作中的應(yīng)用…………………………………… 劉愛(ài)軍，焦有權(quán)，黃海力（4-275）

將小麥麩皮粉碎過(guò)100目篩，常溫下儲(chǔ)藏備用。根據(jù)GB 5009.5—2010的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定，其蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為14.22%。

1.3.7 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

對(duì)隨機(jī)抽取的77名同學(xué)從專(zhuān)業(yè)理論知識(shí)、崗位技能水平、學(xué)習(xí)目標(biāo)的明確性、學(xué)習(xí)積極性等四個(gè)方面的個(gè)人水平提高進(jìn)行了調(diào)查，普遍認(rèn)為有幫助(約58%—66%)或者有很大幫助(約22%—28%)，也有少部分同學(xué)(約3.8%—8.7%)認(rèn)為存在問(wèn)題，以學(xué)習(xí)積極性的提高存在困難為首?？梢?jiàn)，課程建設(shè)在幫助學(xué)生提高個(gè)人水平方面滿意度情況較好

第七步：崗位練兵。按戰(zhàn)斗班組將隊(duì)員分為兩組，依次嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)作業(yè)流程開(kāi)展崗位練兵，安全員要全程做好時(shí)間記錄和過(guò)程監(jiān)督，如發(fā)現(xiàn)練兵過(guò)程中存在未按崗位標(biāo)準(zhǔn)作業(yè)流程執(zhí)行，則對(duì)照考核細(xì)則進(jìn)行加時(shí)懲罰；如發(fā)現(xiàn)不安全行為，應(yīng)立即進(jìn)行糾正。其他練兵人員要認(rèn)真觀察練兵過(guò)程。

圖3 緩沖液pH對(duì)小麥麩皮提取率及THA的影響

2.1.4 緩沖液濃度對(duì)蛋白質(zhì)提取率及THA的影響

在液料比6∶1、提取時(shí)間4 h、80%飽和硫酸銨條件下，研究緩沖液濃度（pH 7.4）對(duì)蛋白質(zhì)提取率及THA的影響。由圖4可知，提取率隨著緩沖液濃度的增加呈上升趨勢(shì)，緩沖液濃度為20 mmol／L以上時(shí)，較10 mmol／L是的提取率上升了近10%，說(shuō)明緩沖液濃度對(duì)是提高提取率的關(guān)鍵因素之一。造成這一較大影響的因素可能是：當(dāng)緩沖液達(dá)到某一濃度時(shí)，其離子強(qiáng)度增加，對(duì)目標(biāo)蛋白的作用加強(qiáng)，有助于其溶出。隨著PBS緩沖液濃度的進(jìn)一步提高，蛋白提取率無(wú)明顯變化，因此將中心點(diǎn)取在30 mmol／L較為合適。同時(shí)，由圖4可知，緩沖液濃度對(duì)THA無(wú)明顯影響。

圖4 緩沖液濃度對(duì)小麥麩皮提取率及THA的影響

2.1.5 飽和硫酸銨濃度對(duì)蛋白質(zhì)提取率及THA的影響

采用飽和硫酸銨溶液對(duì)蛋白上清液進(jìn)行沉淀，能有效富集蛋白質(zhì)。由圖5可知，蛋白質(zhì)提取率與飽和硫酸銨濃度基本正相關(guān)，飽和硫酸銨溶液的濃度越高，提取率越高，富集效果越好。因此，可采用100%對(duì)上清液進(jìn)行沉淀。由圖5可知，隨著飽和硫酸銨濃度的升高，THA有逐漸變大的趨勢(shì)，當(dāng)飽和硫酸銨濃度達(dá)80%時(shí)，THA增大趨勢(shì)變緩。

圖5 飽和硫酸銨濃度對(duì)小麥麩皮提取率及THA的影響

2.2 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)合響應(yīng)面分析法優(yōu)化提取工藝參數(shù)

2.2.1 模型的建立

Pyris Diamond差示掃描量熱儀：美國(guó)Perkin－Elmer公司；透析膜（44 mm，截留分子質(zhì)量6 ku）：上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；UV－2800型紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì)：尤尼柯（上海）儀器有限公司。

由Design Expert軟件分別對(duì)蛋白提取率與THA結(jié)果進(jìn)行二次回歸擬合分析，得到Y(jié)1（蛋白提取率）及Y2（THA）對(duì)自變量的多項(xiàng)式模型方程。

值得說(shuō)明的是,關(guān)于為什么上述斜向垂直環(huán)流圈在某一時(shí)段能夠形成而在另一時(shí)段不能形成的原因則還需進(jìn)一步探索。

由表3可知，Y1模型方程的P值小于0.001，Y2模型方程的P值小于0.05，表明模型方程均為顯著。兩模型方程的決定系數(shù)（R2）分別為0.938 6與0.801 3，R2均大于0.80，可以認(rèn)為方程的擬合情況較好［13－15］。因此