黃 晶

濟南軍區(qū)總醫(yī)院心血管病研究所 濟南 250022

肌萎縮側(cè)索硬化癥（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）是—種累及腦與脊髓上下運動神經(jīng)元，導致肌肉無力、萎縮，言語、吞咽、呼吸功能障礙的遲發(fā)性神經(jīng)變性疾?。?］。一般患者的生存期為3～5a，大多死于呼吸衰竭。ALS的發(fā)病率為1～6／10萬人，終生發(fā)病風險約為1∶400，發(fā)病風險隨年齡而增加，在50～75歲達高峰，此后出現(xiàn)下降。根據(jù)發(fā)病特征，可將ALS分為有家族遺傳史的家族性ALS（Familial ALS，F(xiàn)ALS）和散發(fā)性ALS（Sporadic ALS，SALS），F(xiàn)ALS具有明顯的遺傳傾向，因而致病基因容易被鑒定，但FALS只占到ALS患者的5%～10%，絕大多數(shù)的ALS患者為SALS，SALS病因較為復雜，常涉及到環(huán)境、基因等多種因素［2］。本文對ALS的致病基因進行回顧，并總結(jié)了研究ALS致病基因的方法，以便發(fā)現(xiàn)更多的ALS相關(guān)基因。

1 連鎖分析

很多ALS家系表現(xiàn)出經(jīng)典的孟德爾遺傳模式，提示具有高外顯率突變。FALS主要通過常染色體顯性遺傳，但也有報道常染色體隱性遺傳和X-連鎖遺傳［3-4］。符合孟德爾遺傳定律的遺傳性狀可以通過連鎖分析進行研究。連鎖分析是利用遺傳標記在家系中進行基因分型，再利用數(shù)學手段計算遺傳標記在家系中是否與疾病產(chǎn)生共分離。由于致病基因和遺傳標記通常在一條染色體上，連鎖就傾向于他們一起遺傳給下一代。直到1989年第一個成年起病的家族性ALS的致病位點通過連鎖分析確定在21號染色體上，在此之前，ALS的遺傳基礎(chǔ)都是迷［5］。這個位點的突變基因后來通過單鏈構(gòu)想多態(tài)性分析確定為SOD1，通過外顯子直接測序鑒定了SOD1的幾個錯義突變［6］。至今，已報道了170多個SOD1的突變位點（具體參見ALS在線遺傳數(shù)據(jù)庫ALSoD，網(wǎng)址為：http：／／alsod.iop.kcl.ac.uk／），這些占到FALS病例的20%。在成功的發(fā)現(xiàn)這些位點后，利用經(jīng)典的連鎖分析研究又發(fā)現(xiàn)了10個ALS相關(guān)的新位點（見表1）。在這些位點中，成人發(fā)病型的ALS最常見的突變有以下基因：SOD1，F(xiàn)US［7］，TARDBP（又 名TDP-43）［8］和C9ORF72［9］。與其他ALS相關(guān)基因的突變類型為單核苷酸變異相比，C9ORF72的變異鑒定為一個六核苷酸GGGGCC（G4C2）的重復。青少年型的ALS最常見的發(fā)生突變的基因有ALS2［10］和SPG11［11］。

2 候選基因關(guān)聯(lián)分析

由于大多數(shù)的ALS病例沒有家族史，因此需要有替代的方法來研究易感基因。候選基因關(guān)聯(lián)研究就是一種基于比較獨立病例組和對照組的候選基因突變頻率的代表方法。FALS與SALS除了在平均發(fā)病年齡上FALS要早接近十年外，在臨床上并沒有本質(zhì)區(qū)別，因此幾個研究小組試圖研究FALS的相關(guān)基因在SALS中的作用。這些研究揭示：SOD1，F(xiàn)US和TARDBP僅在少數(shù)（＜2%）散發(fā)病例中出現(xiàn)突變，而C9ORF72的G4C2重復在全球SALS中占到6%，在瑞典和芬蘭人群中則達到15%～20%［12］，這是迄今為止明確的SALS最常見的致病基因。除了FALS相關(guān)致病基因作為候選基因外，還有候選基因研究是基于基因功能涉及其它運動神經(jīng)元疾病的基因研究，其中最顯著的有VEGF，NEFH，ANG，PON，APEX和PRPH。然而，大多數(shù)候選基因研究在后期驗證中會得出矛盾的結(jié)果，僅有幾個得到重復，這使這些基因在ALS中的作用難以得到一致的結(jié)論。

3 全基因組關(guān)聯(lián)研究

全基因組關(guān)聯(lián)分析（genome-wide association study，GWAS）是在全基因組的范圍內(nèi)查找存在變異的序列，即單核苷酸多態(tài)性，從中篩選出疾病相關(guān)的位點。GWAS與候選基因關(guān)聯(lián)分析不同，它并不基于特定的假說。GWAS是在兩個大樣本人群：病例組和對照組中，在全基因組范圍內(nèi)比較常見的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）的等位基因頻率，來尋找病例組中常見的低外顯率的突變（不包括罕見變異）的病例對照研究。GWAS已經(jīng)成為遺傳學有力的研究方法，并應用于50多種疾病致病基因的研究中（如2型糖尿?。?3］和多發(fā)性硬化?。?4］）。過去幾年，多個GWAS研究致力于SALS易感基因的研究，其中報道的具有顯著易感性的基因有：FLJ1098675［15］、ITPR2、DPP6、ELP3、1q32區(qū)域覆蓋的CAMK1G基因［16］、22p11區(qū)域覆蓋的CABIN1，SUSD2和UNC13A基因。值得注意的是，UNC13A基因突變與SALS易感性及減少存活時間上都有顯著的關(guān)聯(lián)［17］。然而，有些遺傳相關(guān)性在后續(xù)的獨立研究中不能得到重復，而且與疾病相關(guān)的風險比值比通常也比較低［18］。值得注意的是，對GWAS研究所篩選到的候選基因進行外顯子測序，也沒能確定ALS患者特有的顯著性富集的突變。研究表明，罕見的遺傳異質(zhì)性疾病如ALS，要想識別和獲得令人信服并能復制的遺傳相關(guān)性是非常有挑戰(zhàn)性的，且常見的SNP作為ALS的致病基因未占據(jù)很大比例。

4 基因組結(jié)構(gòu)變異

基因組結(jié)構(gòu)變異主要包括染色體重排和拷貝數(shù)變異（copy number variants，CNV），是導致人類形態(tài)多樣化，遺傳多樣性及疾病的主要原因。然而經(jīng)常會檢測到神經(jīng)發(fā)育疾病與染色體結(jié)構(gòu)或數(shù)目變異，CNV之間存在關(guān)聯(lián)性，但是這些變異在遲發(fā)性疾病病因中所起的作用還不太清楚。在ALS中，僅有Kaneko和Meyer兩個研究報告了染色體異位或倒置［19］，在Meyer的研究中，五個家族中四個也發(fā)現(xiàn)了這種畸變［20］。對于拷貝數(shù)變異，候選基因的CNV分析表明，SALS中存在SMN1基因異常拷貝數(shù)（1個或3個拷貝），該基因的缺失會引發(fā)脊髓性肌萎縮癥［21］。全基因組CNV分析顯示，SALS患者雜合性缺失區(qū)域包含的基因要遠遠多于正常人［22］。在這之后，另一個全基因組CNV分析顯示SALS的平均數(shù)及擴增的中值也高于對照。雖然這些基因研究被看好，但是重復試驗沒有得到一致的結(jié)果。而且，以基因為基礎(chǔ)的全基因組CNV分析表明，如果采用Bonferroni校正的多重比較方法，CNV涉及到的基因都與ALS沒有顯著性的關(guān)聯(lián)，或者在獨立的重復試驗中效果并不顯著［22］。因此，這些研究中常見的CNV都與SALS無關(guān)，罕見的CNV可能與SALS的致病機制有關(guān)。

5 新一代測序-全外顯子捕獲

2009年Ng等人第一次確認全外顯子測序（Whole exome sequencing，WES）作為一種鑒定疾病相關(guān)的突變的方法［23］，WES是利用序列捕獲技術(shù)將全基因組外顯子區(qū)域DNA捕獲并富集后進行高通量測序的基因組分析方法。人類基因組中大約有180 000個外顯子，約占人類基因組的1%，約30MB。生成的數(shù)據(jù)可以利用生物信息學軟件及開放數(shù)據(jù)庫進行分析，經(jīng)過幾步過濾最終獲得疾病特有的突變，從而確定致病基因。WES用于家系分離疾病的優(yōu)勢在于，即使家系太小無法做連鎖分析，WES也可以鑒定所有編碼區(qū)的突變。WES在ALS領(lǐng)域產(chǎn)生了重大影響，因為它不僅可以鑒定已知ALS致病基因的新發(fā)突變（如在SALS中發(fā)現(xiàn)SOD1，SPG11，UBQLN2基因的新發(fā)突變），而且在FALS中發(fā)現(xiàn)幾個新的致病基因：Johnson等在5個FALS家系中找到了VCP基因的4個突變［24］；吳等在7個ALS家系中發(fā)現(xiàn)PFN1基因的4個突變［25］；Kim等在兩個ALS家系中發(fā)現(xiàn)hnRNPA1基因的兩個突變［26］。

WES還為從三人家系（患者及其雙親）中識別原發(fā)突變提供有效的方法。事實上，WES已為神經(jīng)發(fā)育障礙、精神分裂癥、智障等多種疾病鑒定了許多原發(fā)突變［27］?？紤]到ALS散發(fā)的特性，測試原發(fā)突變對疾病的貢獻在原則上是可行的。然而，ALS是一種遲發(fā)性的疾病，因此不能像早發(fā)性疾病那樣可以獲得較多的DNA樣本。盡管Alexander等人之前有報道原發(fā)突變對ALS的影響，但是突變基因為已知基因［28］，目前為止，Chesi等人的報道是唯一一個使用WES方法來評估原發(fā)突變對SALS可能的貢獻。在Chesi等人的研究中，他們對47個三聯(lián)家系進行系統(tǒng)分析，計算出原始突變率為0.64%（原始突變數(shù)與患者數(shù)的比值）。而且與對照相比SALS患者的原發(fā)突變基因集中在染色體調(diào)節(jié)通路上。值得注意的是，用作對照的非ALS數(shù)據(jù)集是從以往的研究中搜集的，因此捕獲方法的差異、測序平臺的差異以及覆蓋度、生物信息學分析的差異都有可能影響結(jié)果。為了克服捕獲、測序帶來的影響，可以計算每個核苷酸序列的原發(fā)突變率而非家系的原發(fā)突變率。不知使用這種策略Chesi等的研究結(jié)果能否得到復制，或者在更大樣本量中能否得出一致結(jié)論。

最后，隨著WES數(shù)據(jù)集的增多，通過收集特定區(qū)域的基因突變來規(guī)避稀缺變異的替代分析方法可能會實現(xiàn)。而且，隨著可用的WES數(shù)據(jù)集的增加，我們可以根據(jù)共同的內(nèi)在表型對案例進行分組，然后進行測序kernel關(guān)聯(lián)分析（sequence kernel association tests，SKAT）。SKAT是一種根據(jù)突變頻率添加線性或?qū)?shù)權(quán)重分析的算法，這種算法可以幫助確定一個突變子集，然后通過檢測每個變量的疊加效應來測試子集中的突變與特定表型的關(guān)聯(lián)。

盡管ALS的病因尚未完全明確，但是遺傳學在其發(fā)病中所起的作用已得到公認。目前為止，全世界總共發(fā)現(xiàn)了17種與ALS相關(guān)的突變基因，其中C9orf72、SOD1、TARDBP、FUS被認為是白種人ALS患者中排名前四位的突變基因，然而有關(guān)中國人種ALS患者常見致病基因的突變情況尚缺乏系統(tǒng)性的研究。因此，本篇關(guān)于ALS致病基因研究方法的綜述，希望可以幫助更多研究學者更快發(fā)現(xiàn)ALS致病基因，為早日闡明中國人種ALS的發(fā)病機制奠定基礎(chǔ)。

表1 ALS相關(guān)的致病基因列表

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