文革生 林梅芳 鄧慶先 黃永坤

新生大鼠壞死性小腸結(jié)腸炎腸道組織含半胱氨酸的Caspase3與PCNA表達的意義

文革生 林梅芳 鄧慶先 黃永坤

目的 觀察新生大鼠壞死性小腸結(jié)腸炎腸道組織含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Caspase3）與增殖細胞核抗原（PCNA）表達，探討新生大鼠壞死性小腸結(jié)腸炎（NEC）疾病過程中Caspase3 和PCNA表達的意義及相關(guān)性。方法 新生SD大鼠24只隨機分為空白對照組和NEC模型組，每組12只?？瞻讓φ战M予鼠乳代乳品人工喂養(yǎng)3 d；NEC模型組采用代乳品喂養(yǎng)+缺氧+冷刺激，連續(xù)3 d建立NEC模型。3d后處死，采用免疫組織化學方法檢測各組大鼠腸組織Caspase3和PCNA的表達，兩組間比較釆用Wilcoxon秩和檢驗，并對NEC模型組腸組織Caspase3和PCNA的表達行Spearman相關(guān)檢驗。結(jié)果 NEC模型組腸組織Caspase3表達指數(shù)（77.3±8.65）%明顯高于空白對照組（18.92±3.37）%，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.0000）。而NEC模型組腸組織PCNA表達指數(shù)（15.00±1.94）%明顯低于空白對照組（34.17±5.78）%、差異有統(tǒng)計學意義（P=0.0001），NEC模型組腸道組織病理評分與Caspase3的表達指數(shù)（P=0.005）、Caspase3/PCNA表達指數(shù)比（P=0.0016）呈正相關(guān)；而與PCNA表達指數(shù)呈負相關(guān)（P=0.014）。結(jié)論 Caspase3可能通過表達上調(diào)參與了NEC的疾病過程，而PCNA可能通過下調(diào)表達量參與了NEC的疾病過程，細胞增殖和凋亡失衡對NEC的發(fā)生發(fā)展有一定關(guān)系。

壞死性小腸結(jié)腸炎 含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3 增殖細胞核抗原

新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎（necrotizing enterocolitis，NEC）是新生兒時期較為嚴重的腸道疾病，病死率高，發(fā)病機制尚未完全闡明。含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase）是一組存在于細胞質(zhì)中具有類似結(jié)構(gòu)的蛋白酶，而Caspase3與真核細胞凋亡密切相關(guān)，Caspase3是研究細胞凋亡重要指標之一。增殖細胞核抗原（preliferating cell nuclear antigen，PCNA）作為一種在增殖細胞中合成或表達的核內(nèi)多肽，其表達高低代表著細胞增殖的強弱，反映了腸黏膜細胞的增殖和局部細胞的增生情況［1］。本資料選擇通過觀察NEC大鼠腸道Caspase3和PCNA表達，探討NEC疾病過程中Caspase3和PCNA表達的意義及其相關(guān)性，為進一步深入研究NEC的發(fā)病機制提供資料。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 （1）實驗動物：不同窩別的新生SD大鼠（出生48h［2］）24只（昆明醫(yī)科大學動物實驗科提供），雌雄不限，體重5.0～8.0 g，飼養(yǎng)環(huán)境溫度23℃～25℃，濕度70%～80%，采用12h晝夜間斷照明。（2）NEC模型的建立［3］：將新生大鼠中雌鼠分離，用24 G密閉式靜脈留置針（蘇州碧迪醫(yī)療器械有限公司）連接1 ml注射器替代胃管給予鼠乳代乳品喂養(yǎng)，鼠乳代乳品的配制參考Auestad等［4］的配方，脂肪116.3 g/L，蛋白質(zhì)107g/L，碳水化合物27g/L，熱量6616 KJ/L。分別于每日9：00、13：00、17：00和21：00時喂養(yǎng)4次。9：00和21：00時喂養(yǎng)后，將大鼠置于缺氧艙（杭州艾普儀器設(shè)備有限公司）中，測氧儀調(diào)零后，設(shè)置氮氣流量為15L/min，當測氧儀（杭州匯銳儀器設(shè)備有限公司）顯示氧濃度為0%時開始計時，90s后關(guān)閉氮氣閥門，打開缺氧艙，取出新生大鼠放入4 ℃冰箱（北京福意電器有限公司）10min。連續(xù)3d，建立NEC模型。（3）分組及處理：24只新生大鼠隨機分為空白對照組和NEC模型組，每組12只。兩組實驗鼠分別于每日9：00、13：00、17：00和21：00時喂以鼠乳代乳品4次，空白對照組不做任何干預(yù)，連續(xù)3d；NEC模型組采用代乳品喂養(yǎng)+缺氧+冷刺激，連續(xù)3d建立NEC模型。

1.2 方法 （1）體重的測量：實驗開始前及第3天末次人工喂養(yǎng)后空腹1 h處死前采用電子天平（MD2K-2，上海天平儀器廠）稱重，并記錄大鼠體重。（2）腸道組織標本取材：于實驗第3天末次人工喂養(yǎng)后空腹1h頸椎脫臼法處死大鼠，分離腸組織。距回盲部4 cm范圍內(nèi)剪取3 cm長全層回腸末端組織，部分腸組織用于形態(tài)學觀察，其余腸組織分為2份，立即甲醛固定、石蠟包埋，用于病理學檢查及檢測腸組織Caspase3和PCNA的表達指數(shù)的檢測。（3）腸組織病理變化：取石蠟包埋組織，切片，HE染色觀察病理變化，采用Nadler標準［5］進行腸組織損傷評分。腸道絨毛和上皮完整，組織結(jié)構(gòu)正常，記0分；輕微黏膜下和（或）固有層腫脹分離，記1分；中度黏膜下和（或）固有層分離，黏膜下和（或）肌層水腫，記2分；重度黏膜下和（或）固有層分離，黏膜下和（或）肌層水腫，局部絨毛脫落，記3分；腸道絨毛消失伴腸壞死，記4分。每張切片觀察3個視野，取其平均值。評分≥2分診斷NEC。（4）腸組織Caspase3和PCNA的表達指數(shù)的檢測：采用免疫組織化學方法進行檢測。取石蠟包埋組織切片，脫蠟、至水，滴加過氧化物酶，熱修復(fù)抗原，滴加封閉液，分別滴加1：50稀釋的抗大鼠活化Caspase3多克隆抗體，和抗大鼠PCNA單克隆抗體，滴加1：50稀釋的二抗，二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木素復(fù)染、脫水、透明，中性樹脂封片。Caspase3、PCNA的表達指數(shù)的檢測［6］：每張實驗鼠腸道免疫組織化學切片在低倍鏡下選擇背景清晰、組織結(jié)構(gòu)良好的5個陽性細胞最密集區(qū)域，每個區(qū)域在200倍光鏡下，計數(shù)定位準確的陽性細胞并記分。陽性細胞標準：切片染色對比度好，背景清晰；陽性細胞定位要準確；出血、壞死、受擠壓的組織及切片邊緣不應(yīng)作為判斷的依據(jù)。在符合以上3個基本條件的前提下，兼顧陽性染色的強度和數(shù)量計分，計算2種記分的乘積，乘積＞3確認為是免疫反應(yīng)陽性。染色強度計分：染色強度極弱或不染色者為0分，淡黃色記為1分，棕黃色記為2分，棕褐色記為3分；陽性細胞數(shù)計分：0分為陰性，≤10%為1分，11%～50%為2分，51～75%為3分，＞75%為4分。最后計算2種記分的乘積，計分的乘積＞3分才判定免疫反應(yīng)陽性。（1）Caspase3的表達指數(shù)：每鼠取3張不連續(xù)切片，每張切片在低倍鏡下選擇背景清晰、組織結(jié)構(gòu)良好的5個陽性細胞最密集區(qū)域，計數(shù)陽性細胞和總細胞數(shù)，取其均值，Caspase3表達指數(shù)=陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。（2）PCAN的表達指數(shù)：每鼠取3張不連續(xù)切片，每張切片隨機選取10個完整的腸隱窩區(qū)，計數(shù)每個隱窩絨毛中的陽性細胞和總細胞數(shù)，取其均值，計算PCNA陽性表達指數(shù)，即陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（x±s）表示，組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組新生大鼠一般情況及體重變化 空白對照組實驗鼠每天進食正常，無胃潴留、腹脹，一般情況良好。NEC模型組新生大鼠在造模24 h后相繼出現(xiàn)不同程度的嗜睡、反應(yīng)遲鈍、胃潴留、腹脹、腹瀉、活動減少，甚至皮溫降低、皮膚蒼白、呼吸節(jié)律改變、其中2只大鼠于實驗開始后70和71 h死亡。NEC模型組體重負增長明顯，見表1。

表1 兩組實驗鼠各指標的變化（x±s）

2.2 腸組織病理改變 空白對照組實驗鼠腸組織顏色正常，光澤、彈性好。NEC模型組可見腸組織色澤變暗，腸腔積氣、擴張，外觀呈串珠樣改變，部分腸腔充血壞死。見圖1。

圖1 各組大鼠腸組織病理改變（HE×400）

2.3 腸組織Caspase3、PCNA的的表達指數(shù)及相關(guān)性分析 NEC模型組腸組織Caspase3表達指數(shù)（77.3±8.65）%明顯高于空白對照組（18.92±3.37）%（P=0.0000）；而NEC模型組腸組織PCNA表達指數(shù)（15.00±1.94）%明顯低于空白對照組（34.17±5.78）%（P=0.001）；NEC模型組腸組織Caspase3表達指數(shù)/ PCNA表達指數(shù)（515.33±57.30）%明顯高于空白對照組（55.37±5.30）%（P=0.0000）。進一步對NEC模型組Caspase3、PCNA的表達指數(shù)及Caspase3/PCNA表達指數(shù)比分別與腸道組織病理評分行Spearman相關(guān)性分析：NEC模型組腸道組織病理評分與Caspase3的表達指數(shù)（r=0.7689，P=0.005）、Caspase3/PCNA表達指數(shù)比（rs=0.8346，P=0.0016）呈正相關(guān)；而與PCNA表達指數(shù)（rs=-0.6985，P=0.014）、實驗鼠體重增長呈負相關(guān)（rs=-0.7270，P=0.01）。

3 討論

研究［7］認為腸道細胞凋亡可能是NEC腸道壞死的開始，腸道細胞凋亡在NEC發(fā)病中所起的作用越來越受到重視［8～10］。由于在動物中并未發(fā)現(xiàn)“白發(fā)的NEC”，故作者將出生48h的新生SD大鼠，運用人工喂養(yǎng)+缺氧+寒冷刺激的方法建造了NEC動物模型［3］。各組實驗鼠腸道組織病理觀察發(fā)現(xiàn)，空白對照組解剖空腸組織肉眼觀察顯示顏色正常，光澤、彈性好，腸黏膜完整，結(jié)構(gòu)正常；NEC模型組可見腸組織色澤變暗，腸腔積氣、擴張，外觀呈串珠樣改變，腸黏膜腸組織出血、腸絨毛脫落、壞死。說明模型制備成功。

Caspase是一類存在于細胞質(zhì)內(nèi)的天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白酶，為一類蛋白酶家族，成員較多，其中Caspase3是介導(dǎo)細胞調(diào)亡的核心蛋白酶，亦是Caspase級聯(lián)反應(yīng)最關(guān)鍵的效應(yīng)蛋白酶［11，12］。本研究發(fā)現(xiàn)，NEC模型組腸組織Caspase3的表達明顯高于空白對照組，證實Caspase3可能通過上調(diào)表達參與了NEC的發(fā)展。以上實驗均表明腸道細胞凋亡在NEC疾病過程起著重要作用。

PCNA是一種細胞增殖的重要標志物，在DNA復(fù)制、細胞增殖及細胞調(diào)控中發(fā)揮著重要作用［13］，Del Giglio A等［14］對慢性淋巴細胞性白血病小腸缺血再灌注損傷研究時顯示PCNA的表達變化與腸道上皮細胞增殖分化相一致，腸道上皮PCNA的表達先降后升。劉春英等［15］在對腹腔注射內(nèi)毒素的Wistar大鼠胃黏膜組織PCNA表達研究發(fā)現(xiàn)實驗組胃黏膜組織PCNA表達較對照組明顯減低。但在NEC疾病過程中腸道上皮PCNA表達情況國內(nèi)外少有報道，本資料結(jié)果顯示空白對照組實驗鼠腸道組織PCNA表達指數(shù)明顯高于NEC模型組，表明PCNA可能通過下調(diào)表達參與了NEC的疾病過程。說明PCNA表達高低能顯示胃腸道上皮腸黏膜細胞增殖的強弱，進而反映胃腸道上皮腸黏膜細胞增殖和局部細胞增生情況。婁閣等［16］在宮頸癌組織細胞凋亡及PCNA表達的研究發(fā)現(xiàn)細胞增殖和凋亡失衡與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有一定關(guān)系，兩個指標比值不同，可能直接影響宮頸癌的預(yù)后，并提出二者的比值可能是判定宮頸癌預(yù)后的一個可靠指標。本文對NEC模型組腸道組織病理評分與Caspase3、PCNA表達指數(shù)及Caspase3/PCNA表達指數(shù)比行Spearman相關(guān)性分析，分析顯示NEC模型組腸道組織病理評分與Caspase3表達指數(shù)及Caspase3/PCNA表達指數(shù)比呈正相關(guān)，而與PCNA表達指數(shù)及實驗鼠體重增長呈負相關(guān)，說明細胞增殖和凋亡失衡與NEC的發(fā)生發(fā)展同樣有一定關(guān)系。

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Objective To study the expressions of Cysteinyl aspartate specific proteinase 3（Caspase3） and proliferating cell nuclear antigen（PCNA）in intestinal tissue of neonate rats with necrotizing enterocolitis，in order to explore their significance and their correlation. Methods Randomly selected 24 neonate rats at the age of 48 hours，were divided into 2 groups.12 rats every group，Blank control group and NEC model group. Blank control group rats were given artificial feeding with self-control milk. NEC model group rats were given artificial feeding with self-control milk and cold exposure after hypoxic-reoxygen twice a day for 3 days.Detected the expression of Caspase3 and PCNA by the method of immunohistochemical . Results The Caspase3 expression index of intestinal tissue in NEC model group （77.3±8.65）% was significantly higher than the control group （18.92±3.37）%，and the difference was statistically significant （P=0.0000）. While the PCNA expression index of the intestinal tissue in the NEC model group（15±1.94）% was significantly lower than the control group （34.17±5.78）%，and there was statistical significance（P=0.0001）.The correlation were positive Between the Caspase3 expression（P=0.005），Caspase3/PCNA ratio （P=0.0016）and pathological score of the intestinal tissues in the NEC model group.They showed negative correlation between the PCNA expression ，and pathological score of the intestinal tissues in the NEC model group （P=0.5321）.Conclusions The Caspase3 maybe involved in the NEC’s disease process by up regulating its expression and PCNA maybe involved in the disease process of NEC by down-regulating its expression. The balance between apoptosis and proliferation should be destroyed during the disease process of NEC.

Necrotizing enterocolitis Cysteinyl aspartate specific proteinase 3 Preliferating cell nuclear antigen

313000浙江省湖州市婦幼保健院新生兒科（文革生林梅芳 鄧慶先）

650032昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院兒科（黃永坤）