陳盈 周永列 酈衛(wèi)星 王歡?

納米磁珠聯(lián)合質(zhì)譜技術(shù)篩選大腸癌患者血清特異性蛋白標(biāo)志物

陳盈 周永列 酈衛(wèi)星 王歡?

目的 通過納米磁珠聯(lián)合質(zhì)譜技術(shù)篩選并鑒定大腸癌患者特異性蛋白標(biāo)志物及在大腸癌早期診斷中的意義。方法 采用弱陽離子納米磁珠聯(lián)合MALDI-TOF-MS質(zhì)譜技術(shù)分析102例大腸癌患者和124例健康對(duì)照者血清蛋白表達(dá)譜，并建立蛋白分類模型，采用LCQ液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜（LC-MS）技術(shù)鑒定已篩選出的特異性蛋白，并用該模型在雙盲模式下從使用未建立模型的其它樣本中選取59例大腸癌血清標(biāo)本（Dukes A、B、C期各33例、18例和8例）和正常體檢者90例進(jìn)行檢測以驗(yàn)證其診斷的準(zhǔn)確性。結(jié)果 大腸癌組與健康對(duì)照組間有8個(gè)蛋白表達(dá)存在明顯差異（P＜0.05），其中大腸癌患者中有3個(gè)蛋白質(zhì)高表達(dá)。差異蛋白質(zhì)峰［質(zhì)荷比（m/z）2963.17、4095.13、5906.83和38146.5］為最佳的大腸癌患者血清學(xué)診斷模型，敏感性為82.3%，特異性為90.3%，陽性預(yù)測值為90.3%，ROC曲線下面積為0.922。在雙盲模式下的診斷準(zhǔn)確率為89.83%，排除率為94.44%。其差異蛋白峰和大腸癌的分期無明顯相關(guān)。LC-MS成功鑒定到m/z 2963.17（myosin-7B）、m/z 5906.83（Myoferlin）。結(jié)論 納米磁珠聯(lián)合質(zhì)譜技術(shù)對(duì)大腸癌患者血清學(xué)診斷具有較高靈敏度和特異性，并通過LCQ液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜成功鑒定到的myosin-7B和Myoferlin可能有助于大腸癌的早期診斷。

大腸癌 早期診斷 LCQ液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜 肌球蛋白重鏈7B

大腸癌是常見的惡性腫瘤，已成為世界男性第三位、女性第二位高發(fā)的惡性腫瘤［1，2］。臨床上發(fā)現(xiàn)的大腸癌患者5年生存率＞90%，約有1/3的患者就診時(shí)已屬中晚期，且中位生存期僅數(shù)月［1，2］。本研究運(yùn)用弱陽離子納米磁珠（MB-WCX）和基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）對(duì)大腸癌患者與健康人血清中的蛋白質(zhì)譜進(jìn)行分析比較，并用LCQ液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜（LC-MS）鑒定差異蛋白，以尋求大腸癌早期診斷的特異性蛋白標(biāo)志物。

1 臨床資料

1.1 一般資料 本院2012年10月至2014年10月住院的大腸癌患者102例。男58例，女44例；年齡50～75歲，中位年齡66.5歲。病理分期：Dukes A期61例，Dukes B期31例，Dukes C期10例。取124例健康體檢者作為正常對(duì)照組，男72例，女52例；年齡49～77歲，中位年齡65歲。所有標(biāo)本經(jīng)病理學(xué)確診。本項(xiàng)目取得患者知情同意。

1.2 主要儀器與試劑 弱陽離子磁珠為長春博坤生物科技有限公司，質(zhì)譜儀為美國Biorad公司MALDITOF-MS PBSⅡc。液相色譜為Thermo公司的Surveyor系統(tǒng)，質(zhì)譜為Thermo公司的Deca Xp plus系統(tǒng)。色譜柱為熱電公司BioBasic-18。尿素、U9裂解液（9M Urea，pH9.0）二硫蘇糖醇（DTT）、3-［3-（膽酰胺基丙基）二甲氨基］丙磺酸鹽 （CHAPS）、三氟乙酸（TFA）、芥子酸（SPA）、乙腈（CAN）為美國Sigma公司。緩沖液（50mM NaAC，pH4.0）、SPA飽和液（50%ACN+1%TFA）、標(biāo)準(zhǔn)肽為Arg8-Vasopressin，Somatostatin，Bovine Insulin Beta-Chain，Human Insulin，Hirudin BHVK，質(zhì)控血清樣品購自北京德易檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心。

1.3 方法 （1）標(biāo)本采集：離心力1500g 離心5min后置-80℃冰箱保存。（2）樣品處理：取標(biāo)本上清10μl與20μl U9裂解液混勻，振蕩冰浴孵育30min加370μl緩沖液稀釋。（3）弱陽離子納米磁珠的活化與蛋白捕獲：將10μl納米磁珠加入含有100μl緩沖液的PCR管并震蕩5min，棄液體；重復(fù)1次。在PCR管每孔中加100μl稀釋血清，600rpm，4℃震蕩1h，棄液體。每孔加100μl結(jié)合緩沖液，600rpm震蕩5min，棄液體；重復(fù)1次。每孔加200μl HPLC水，立刻棄出。1%TFA10μl加入PCR管中，5μl蛋白洗脫液加入5μl SPA飽和液，混合后取2μl點(diǎn)樣，風(fēng)干后上機(jī)。（4）質(zhì)譜分析：用5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)肽對(duì)質(zhì)譜儀進(jìn)行校正，使系統(tǒng)質(zhì)量偏差為0.1%，通過Ciphergen Pmteinchip 3.1軟件輔助完成數(shù)據(jù)讀取。（5）質(zhì)控和重復(fù)性：每間隔7個(gè)樣品加入1個(gè)質(zhì)控血清樣品，使蛋白表達(dá)譜平均變異系數(shù)（CV）＜10%。（6）LCQ液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜分析：待測上清液放入超濾離心管中，10000 rpm，20 min離心后備用。MS/MS數(shù)據(jù)掃描5次，并用pFind Ver 2.6軟件進(jìn)行IPI human Ver. 3.83數(shù)據(jù)庫檢索，參數(shù)：非特異酶切，無修飾位點(diǎn)，前體離子寬度為2 Da，產(chǎn)物離子寬度為0.5Da，肽段Score值＜1.0E-5。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Ciphergen Pmteinchip 3.1軟件和Biomarker Wizard 3.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，峰值強(qiáng)度反映組與組間含量差異，過濾信噪比＜5的蛋白峰。采用SPSSl6.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大腸癌組與健康對(duì)照組血清蛋白表達(dá)譜 見表1。

表1 兩組8個(gè)差異蛋白質(zhì)峰比較（x±s）

2.2 大腸癌患者血清蛋白標(biāo)志物的篩選及診斷模型的建立 8個(gè)差異表達(dá)蛋白聚類分析結(jié)果顯示，4個(gè)蛋白質(zhì)峰（m/z 2963.17、4095.13、5906.83和38146.5）為診斷大腸癌的最佳標(biāo)志物，見圖1；該診斷模型的敏感性為82.3%，特異性為90.3%，陽性預(yù)測值為90.3%；大腸癌的ROC曲線下面積為0.922，見圖2。并發(fā)現(xiàn)4個(gè)差異蛋白質(zhì)峰組成的生物標(biāo)志物（m/z 2963.17、4095.13、5906.83和38146.5）不能將Dukes A、Dukes B和Dukes C期大腸癌患者準(zhǔn)確的分組，與大腸癌的分期無明顯相關(guān)性（P＜0.05）。

2.3 LCQ液質(zhì)聯(lián)用分析結(jié)果 4個(gè)大腸癌最佳標(biāo)志物中有2個(gè)蛋白（m/z 4095.13、38146.5）因含量低而在純化過程中丟失；2個(gè)蛋白（m/z 2963.17、5906.83）已成功鑒定，其二級(jí)質(zhì)譜圖見圖3。氨基酸序列顯示，m/z 2963.17和m/z 5906.83蛋白的肽段匹配。

圖1 大腸癌診斷模型圖（當(dāng)?shù)鞍追宸弦韵聴l件M2963-17≤2．87212并且M5906-83＞ 17．1879 或者M(jìn)2963-17＞ 2．87212 并且M38146-5≤0．032568并且M4095-13≤66．5569，則被模型判斷為大腸癌）

圖2 大腸癌診斷模型的ROC曲線

圖3 LCQ液質(zhì)聯(lián)用所得到的二級(jí)質(zhì)譜圖

3 討論

目前，腫瘤標(biāo)記物如血清癌胚抗原（CEA）當(dāng)前被廣泛用于大腸癌的篩選指標(biāo)，但在其它消化道腫瘤中亦可明顯增高，且發(fā)現(xiàn)相當(dāng)比例的大腸癌患者中CEA表達(dá)陰性［3，4］。纖維腸鏡等內(nèi)鏡檢查由于具有創(chuàng)傷性，不適合健康人群的篩查。脫落細(xì)胞學(xué)檢查取材繁瑣，不易獲得滿意的標(biāo)本，且陽性率低，其臨床應(yīng)用受限［5］。

近年來，蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展從整體上為了解惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展提供較為理想的技術(shù)平臺(tái)［6～8］。本資料在大腸癌患者及健康者之間發(fā)現(xiàn)8個(gè)差異蛋白質(zhì)峰，這種差異蛋白可能由于腫瘤細(xì)胞在侵襲過程中在不同階段所分泌的蛋白質(zhì)不同，其中大腸癌患者有3個(gè)蛋白質(zhì)呈高表達(dá)；而大腸癌患者血清學(xué)診斷模型發(fā)現(xiàn)4個(gè)蛋白質(zhì)峰（m/z 2963.17、4095.13、5906.83、38146.5）為最佳診斷標(biāo)志，具有較高的敏感性（82.3%）、特異性（90.3%）、陽性預(yù)測值（90.3%），與Deng等和Zhu等研究結(jié)果具有一致性［9，10］。對(duì)于建立的大腸癌血清蛋白質(zhì)指紋圖譜診斷模型的驗(yàn)證，作者選用了未建立模型的其他大腸癌血清樣本59例（Dukes A、B、C期分別為33例、18例和8例）和正常體檢者90例進(jìn)行盲篩，得到該模型對(duì)大腸癌診斷的準(zhǔn)確率為89.83%，排除率為94.44%。而對(duì)同樣的血清標(biāo)本采用CEA進(jìn)行檢測，準(zhǔn)確率和排除率明顯低于質(zhì)譜法。

LC-MS分析成功鑒定出m/z 2963.17和m/z 5906.83 2個(gè)蛋白。m/z 2963.17為 肌球蛋白重鏈7B（MYH7B myosin-7B），其在保證肌細(xì)胞正常工作中發(fā)揮著重要的作用［11］。m/z 5906.83為MYOF Isoform 1 of Myoferlin，研究表明，myoferlin與表達(dá)和膜的修復(fù)、重塑有關(guān)，干擾正常myoferlin表達(dá)可能提供抗增殖相關(guān)的治療作用［12］。Turtoi 等報(bào)道m(xù)yoferlin在乳腺癌患者中存在過表達(dá)情況［13］；Wang 等發(fā)現(xiàn)myoferlin是一種新型的與預(yù)測胰腺癌預(yù)后相關(guān)的蛋白［14］。本研究提示，運(yùn)用納米磁珠聯(lián)合質(zhì)譜技術(shù)建立起多蛋白標(biāo)志物構(gòu)建的診斷模型篩選所得到的蛋白質(zhì)譜在大腸癌早期診斷中具有較高靈敏度和特異性，該技術(shù)有望成為臨床早期診斷大腸癌的快速、高效、靈敏的檢測手段。并通過前述技術(shù)在大腸癌中篩查并鑒定出的兩種蛋白myosin-7B和 Myoferlin尤其是后者對(duì)大腸癌的早期診斷可能具有重要意義。

1 Brenner H,Kloor M,Pox CP．Colorectal cancer．Lancet,2014, 383(9927): 1490～502．

2 Chen W, Zheng R, Zhang S, et al． Annual report on status of cancer in China, 2010． Chin J Cancer Res,2014,26(1):48～58．

3 Femandes Lc,Kin SB, Matos D．Cytokeratins and carcinoembryonic antigen in diagnosis, staging and prognosis of colorectal adenocarcinoma．World J Gastroenterol, 2005,11 (5):645～648．

4 王全暉,高春芳,王秀麗,等,大腸癌手術(shù)治療前后血清蛋白質(zhì)譜的變化．中華實(shí)驗(yàn)外科雜志, 2004, 21(7):804～806．

5 Tsang AH, Cheng KH, Wong AS, et al． Current and future molecular diagnostics in colorectal cancer and colorectal adenoma．World J Gastroenterol,2014, 20(14):3847～3857．

6 Villanueva J, Shaffer DR, Philip J,et al． Differential exo-protease activities confer tumor-specific serum peptidome patterns．J Clin Invest, 2006, 6(1):271～284．

7 許洋．蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)在實(shí)驗(yàn)診斷與臨床醫(yī)學(xué)中的研究進(jìn)展．基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床, 2007,27(2):134～142．

8 Villanueva J, Law lorK, ToledoCrow R, et al． Automated serum peptide profiling． Nature Protocols,2006,1(2):880～891．

9 Deng BG, Yao JH, Liu QY,et al． Comparative serum proteomic analysis of serum diagnosis proteins of colorectal cancer based on magnetic bead separation and maldi-tof mass spectrometry． Asian Pac J Cancer Prev,2013,14(10):6069～6075．

10 Zhu D, Wang J, Ren L, et al．Serum proteomic profiling for the early diagnosis of colorectal cancer． J Cell Biochem,2013,114(2):448～455．

11 Crawley SW, Shifrin DA Jr, Grega-Larson NE,et al． Intestinal brush border assembly driven by protocadherin-based intermicrovillar adhesion． Cell,2014,157(2): 433～446．

12 Leung C, Yu C, Lin MI, et al． Expression of myoferlin in human and murine carcinoma tumors: role in membrane repair, cell proliferation, and tumorigenesis． Am J Pathol． 2013, 182(5): 1900～1909．

13 Turtoi A, Blomme A, Bellahcène A, et al． Myoferlin is a key regulator of EGFR activity in breast cancer．Cancer Res,2013, 73(17):5438～5448．

14 Wang WS, Liu XH, Liu LX,et al． iTRAQ-based quantitative proteomics reveals myoferlin as a novel prognostic predictor in pancreatic adenocarcinoma．J Proteomics,2013,91(8):453～465．

Objective To screen and identify early specific protein markers of colorectal cancer （CRC）by MALDI-TOF-MS technology. Methods Weak cationic nano magnetic beads combined with MALDI-TOF-MS were used to profile differentially expressed proteins between 102 cases of CRC patients and 124 healthy controls in the serum protein，then constructing protein classification as diagnosis model and identifying specific proteins by LCQ liquid chromatography-mass spectrometry. Selected serum specimens of 59 patients with CRC and 90 normal healthy persons from samples in unestablished model were used to verify the accuracy of diagnosis. Results We found that eight difference protein peaks between CRC patients and healthy group（P＜0.05） and three proteins showed high expression in the CRC patients. A diagnostic model with four proteomic features（m/z 2963.17，4095.13，5906.83 and 38146.5） of CRC patients was generated using Biomarker Patterns Software 5.0 with best performance，the sensitivity was 82.3%，specificity was 90.3%，the positive predictive value was 90.3%，and area under the ROC curve was 0.922. The accuracy rate of diagnosis in double blind mode was89.83%，removal rate was 94.44%. The difference between the protein peaks and the staging of CRC hadno correlation. The identification results showed that m/z 2963.17 （MYH7B，myosin-7B） and m/z 5906.83 （MYOF Isoform 1 of Myoferlin） by LCQ mass spectrometry coupled with liquid. Conclusion Myosin-7B and Myoferlin screened by nano magnetic beads combined with MALDI-TOF-MS technology may contribute to early diagnosis of CRC.

Colorectal cancer Early diagnosis LCQ-LC-MS Myosin-7B

國家自然基金資助項(xiàng)目（81301406）；浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（LQ13H190005）

310014 浙江省人民醫(yī)院檢驗(yàn)中心（陳盈 周永列 王歡）；

310014浙江省臨床檢驗(yàn)中心（酈衛(wèi)星）

*通訊作者