姜 輝，王 斌，高家榮

（1．安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230031；2．安徽中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心，安徽 合肥 230038）

肝樂顆粒（又名疏肝健脾方）為安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院特色院內(nèi)制劑，主治急性肝炎、慢性肝炎、肝纖維化、肝硬化活動(dòng)期，療效確切［1－2］。方中黃芪味甘微溫，入脾、肺經(jīng)，健脾益氣；柴胡味苦辛微寒，入肝膽二經(jīng)，疏肝解郁，兩藥合用則疏肝健脾并舉，共為君藥；白芍養(yǎng)血柔肝，茵陳、白術(shù)、茯苓、薏苡仁、豬苓健脾和胃滲濕為臣藥；佐以澤蘭活血化瘀，板藍(lán)根清熱解毒，以使毒消而正氣自復(fù)。本實(shí)驗(yàn)在前期研究［3－5］基礎(chǔ)上，采用高效液相色譜－蒸發(fā)光散射檢 測(cè) 器 （high performance liquid chromatography－evaporative light scattering detector，HPLCELSD）同時(shí)測(cè)定肝樂顆粒中君藥黃芪活性成分黃芪甲苷和臣藥白芍活性成分芍藥苷的含量，以期建立該制劑的質(zhì)量控制方法。

1 儀器與試藥

1．1 儀器 Agilent1260型高效液相色譜儀（包括在線脫氣機(jī)、二元泵、柱溫箱、380－LC型ELSD）：美國(guó)安捷倫公司；HS10260D型超聲清洗器：天津奧特賽恩斯儀器有限公司；BP211D型十萬分之一電子天平：德國(guó)賽多利斯公司。

1．2 材料 黃芪甲苷（批號(hào)110781－200512）和芍藥苷（批號(hào)110736－200934）對(duì)照品由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。肝樂顆粒（批號(hào)分別為20121204、20131020、20130622）由安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑中心提供；藥材黃芪、柴胡、白芍、茵陳、板藍(lán)根、薏苡仁、枳殼、白術(shù)、豬苓、茯苓和澤蘭均購(gòu)于合肥樂家老鋪中藥飲片有限公司，并經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院孟楣主任中藥師鑒定；水為雙蒸餾水，甲醇為色譜純，石油醚和正丁醇等其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2．1 樣品溶液的制備

2．1．1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱定黃芪甲苷對(duì)照品7．80mg，芍藥苷對(duì)照品9．07mg，加甲醇各自定容至10mL容量瓶中。分別取黃芪甲苷對(duì)照品溶液0．5mL和芍藥苷對(duì)照品溶液1．0mL，配制成混合對(duì)照品貯備液（黃芪甲苷和芍藥苷的質(zhì)量濃度分別為39．0、90．7μg／mL），置4℃冰箱中冷藏備用。

2．1．2 供試品溶液的制備 參照文獻(xiàn)［6］方法，精密稱取肝樂顆粒2．0g，置于具塞錐形瓶中，并加甲醇50mL，超聲處理30min后濾過、蒸干，用水轉(zhuǎn)移殘?jiān)练忠郝┒分校兔演腿∶撝?，再用水飽和的正丁醇萃?次（依次為50、40、40mL），合并正丁醇液，80℃下減壓濃縮后，加等體積氨試液洗滌3次，棄去氨洗液，取正丁醇液蒸干，甲醇溶解所得物，轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶中，定容，過0．45μL針式過濾器后待用。

2．1．3 陰性樣品溶液的制備 按處方量分別制備缺黃芪和缺白芍陰性樣品，按“2．1．2”項(xiàng)下方法制備陰性樣品溶液，過0．45μL針式過濾器后冷藏待用。

2．2 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 以水和甲醇分別為流動(dòng)相A 和流動(dòng)相B，在 Hypersil ODS XB－C18柱（4．6mm×250mm，5μm）上進(jìn)行梯度洗脫。洗脫程序：0～5min，A 60%；6～10min，A 25%；11～18min，A 10%；柱溫：30 ℃；流速：1．2mL／min。ELSD參數(shù)設(shè)置：霧化器溫度70℃，漂移管溫度90℃，增益2．0，載氣流量2．0L／min，進(jìn)樣量20μL。在上述條件下，肝樂顆粒中芍藥苷和黃芪甲苷與其他組分色譜峰可實(shí)現(xiàn)基線分離，與陰性樣品對(duì)比可知，在芍藥苷和黃芪甲苷出峰處無干擾，理論塔板數(shù)以芍藥苷和黃芪甲苷計(jì)均大于4 000，結(jié)果見圖1。

2．3 線性關(guān)系考察 分別取混合對(duì)照品溶液2．0、5．0、10．0、15．0、20．0、25．0μL注入液相色譜儀，分別以2個(gè)對(duì)照品的6個(gè)進(jìn)樣量的峰面積積分值（y）為縱坐標(biāo)，樣品濃度（x）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，芍藥苷和黃芪甲苷的線性回歸方程分別為：y1＝600．34x1－89．604，r1＝0．999 3；y2＝105．52x2－25．131，r2＝0．999 5。結(jié)果表明，芍藥苷和黃芪甲苷進(jìn)樣量分別在0．078～0．975μg和0．181 4～2．267 5μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2．4 精密度試驗(yàn) 參照“2．2”項(xiàng)下的色譜條件，分別取芍藥苷和黃芪甲苷混合對(duì)照品溶液20μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，計(jì)算RSD。所得結(jié)果顯示，芍藥苷和黃芪甲苷峰面積的RSD（n＝6）分別為0．98%和0．47%，表明精密度良好。

2．5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2．1．2”項(xiàng)下制得的樣品溶液（批號(hào)20130622），從0h開始間隔4h分別進(jìn)樣20 μL，24h內(nèi)共進(jìn)樣7次，記錄各自峰面積。結(jié)果顯示，芍藥苷和黃芪甲苷峰面積的RSD分別為1．27%、1．94%。表明樣品溶液在24h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2．6 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2．1．2”項(xiàng)下方法，取同一批號(hào)的樣品（批號(hào)20130622），平行制備6份樣品溶液，測(cè)得各自峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果顯示，芍藥苷和黃芪甲苷含量的RSD分別為1．87%、1．04%。表明該方法重復(fù)性較好。

2．7 加樣回收率試驗(yàn) 稱取肝樂顆粒粉末6份，每份2．0g，精密稱定，加入2mL混合標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備溶液（混合標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備溶液的制備：分別精密稱取芍藥苷和黃芪甲苷對(duì)照品3．32、34．98mg，置50mL容量瓶中，加甲醇溶液溶解，定容，搖勻，按供試品溶液制備方法制備后按上述色譜條件測(cè)定含量。計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2．8 樣品含量測(cè)定 取批號(hào)分別為20121204、20131020、20130622的3批肝樂顆粒內(nèi)容物，每批3份，按“2．1．2”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，共9份。樣品經(jīng)HPLC進(jìn)樣分析，并記錄芍藥苷和黃芪甲苷的峰面積，依照芍藥苷和黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)品線性方程，計(jì)算樣品中芍藥苷和黃芪甲苷的含量。結(jié)果見表2。

表2 3批肝樂顆粒中芍藥苷和黃芪甲苷含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3．1 檢測(cè)器的選擇 肝樂顆粒為中藥復(fù)方，所含成分較為復(fù)雜，原先使用高效液相色譜－二極管陣列檢測(cè)器測(cè)定芍藥苷和黃芪甲苷的含量，由于芍藥苷和黃芪甲苷的最大吸收波長(zhǎng)分別在231nm［7］和200．8 nm［8］，200．8nm 屬于末端吸收，雜質(zhì)和噪音對(duì)該色譜峰的干擾也較大。此外，芍藥苷和黃芪甲苷極性相差較大，需梯度洗脫才能同時(shí)測(cè)定，而梯度洗脫容易造成基線漂移，會(huì)給樣品分析的準(zhǔn)確度帶來誤差。2010年版《中華人民共和國(guó)藥典》［9］規(guī)定藥材黃芪的質(zhì)量控制選用HPLC－ELSD測(cè)定黃芪中有效成分黃芪甲苷的含量，理論塔板數(shù)不低于4 000。ELSD作為一種通用質(zhì)量型檢測(cè)器，其響應(yīng)不依賴樣品的光學(xué)性質(zhì)，只要樣品的揮發(fā)性低于流動(dòng)相即可被檢測(cè)，不存在紫外末端吸收的問題［10］。所以，本實(shí)驗(yàn)采用HPLC－ELSD技術(shù)建立同時(shí)測(cè)定肝樂顆粒中黃芪甲苷和芍藥苷含量的方法。

3．2 樣品處理的優(yōu)化 起初，樣品用甲醇超聲萃取后直接進(jìn)樣分析，但黃芪甲苷和芍藥苷與其他雜質(zhì)組分不能很好分離。后來參照2010年版《中華人民共和國(guó)藥典》一部［9］中藥材黃芪的處理方法，將樣品用甲醇超聲萃取后蒸干萃取液，用水轉(zhuǎn)移殘?jiān)练忠郝┒分?，石油醚脫脂，再用水飽和的正丁醇萃?次，合并正丁醇液，減壓濃縮，加等體積氨試液洗滌3次后棄去氨洗液，正丁醇液蒸干，最后用甲醇溶解后進(jìn)樣分析，樣品中所含雜質(zhì)明顯減少且與黃芪甲苷和芍藥苷都能實(shí)現(xiàn)很好分離。

3．3 ELSD條件的優(yōu)化 使用ELSD時(shí)，蒸發(fā)溫度、載氣流速以及增益值對(duì)測(cè)定結(jié)果影響較大。為此，本研究選擇蒸發(fā)溫度（50、70、90、110 ℃）、載氣流速（1．2、1．6、2．0、2．4L／min）和增益值（1、2、3）進(jìn)行考察。結(jié)果顯示，增益為1時(shí)黃芪甲苷和芍藥苷的響應(yīng)值最小，而增益為3時(shí)黃芪甲苷和芍藥苷的峰面積分別比增益為1時(shí)提高了3．8倍和4．5倍，但此時(shí)信號(hào)／噪音比值卻有所降低。相比較而言，增益為2時(shí)，可獲得較好的信號(hào)／噪音比。因?yàn)榘步輦?80－LC型ELSD的載氣流速默認(rèn)值為1．60L／min，故選擇增益為2，載氣流速為1．60L／min的參數(shù)下考察漂移管溫度在50、70、90、110℃下黃芪甲苷和芍藥苷的響應(yīng)情況。結(jié)果顯示，漂移管溫度為90℃時(shí)無論是芍藥苷還是黃芪甲苷，響應(yīng)值均最大，因此，選擇90℃作為樣品分析的蒸發(fā)溫度。最后，在優(yōu)化了的參數(shù)（增益為2和蒸發(fā)溫度為90℃）條件下繼續(xù)考察載氣流速（1．2、1．6、2．0、2．4L／min）對(duì)樣品分析的影響。當(dāng)載氣的流速較低（1．2L／min）時(shí)，易形成大量的微粒，從而導(dǎo)致噪聲信號(hào)或尖峰信號(hào)；相反，當(dāng)載氣流速較高（2．4L／min）時(shí)，微粒形成量降低，光的散射減弱，導(dǎo)致信號(hào)響應(yīng)降低［6］。相比之下，載氣流速為2．0 L／min時(shí)黃芪甲苷和芍藥苷的基線噪音較小，但信號(hào)響應(yīng)值卻相對(duì)較高。故最終選定在增益為2，漂移管溫度為90℃，載氣流速為2．0L／min的參數(shù)下對(duì)肝樂顆粒進(jìn)行質(zhì)量控制研究。

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