王 帆，儲(chǔ)曉琴，桂雙英

（1．安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230012；2．安徽中醫(yī)藥高等專科學(xué)校，安徽 蕪湖 241000；3．安徽省中藥制劑工程技術(shù)研究中心，安徽 合肥 230012；4．安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院藥物制劑研究所，安徽 合肥 230012）

復(fù)方白芍顆粒由白芍、甘草、澤瀉等中藥組成，為安徽省六安地區(qū)民間祖?zhèn)鹘?jīng)驗(yàn)方，具有滋陰健腎、活血化瘀、除濕化濁的功效。原方采用藥材打粉直接用水沖服給藥，臨床用于治療慢性腎炎、腎功能不全，效果顯著。本課題組采用現(xiàn)代提取與制劑技術(shù)研制了復(fù)方白芍顆粒［1］，為了更好地控制制劑質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)對(duì)其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行研究。白芍和澤瀉分別是該方中的君藥和臣藥，芍藥苷為治療慢性腎病的主要活性物質(zhì)，白芍和澤瀉的薄層鑒別方法及芍藥苷的含量測定方法比較成熟穩(wěn)定，因此本實(shí)驗(yàn)以白芍和澤瀉作為鑒別考察的依據(jù)，芍藥苷作為定量指標(biāo)來控制復(fù)方白芍顆粒質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1．1 儀器 LC－20A高效液相色譜儀：日本島津公司（配有SPD－M20紫外檢測器，LC－20AB泵，LC solution色譜工作站）；AG285型電子天平：德國METTLER公司；循環(huán)水式多用真空泵、R－1001N型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：河南省鄭州長城科工貿(mào)有限公司。

1．2 試藥 芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)110736－201035）：中國藥品生物制品檢定所；23－乙酰澤瀉醇B對(duì)照品（批號(hào) MUST－11040101）：四川省成都曼思特生物科技有限公司；薄層層析用硅膠G、薄層層析用硅膠H：山東省青島海洋化工廠；復(fù)方白芍顆粒為自制（批號(hào)分別為121024、121120、121209）；陰性對(duì)照品為自制；甲醇、乙腈均為色譜純；水為娃哈哈純凈水；其余化學(xué)試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2．1 白芍的鑒別［2－5］取本品顆粒約2．0g，研成細(xì)粉，加甲醇10mL，超聲波（功率100W，頻率40 kHz）30min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)尤?mL甲醇使其溶解，即得供試品溶液；另外取適量的芍藥苷對(duì)照品，加入甲醇適量，使成1mg／mL的溶液，即得對(duì)照溶液；取缺白芍提取物的陰性樣品，按照上述方法制備陰性對(duì)照液；按照《中華人民共和國藥典》2010年版一部附錄ⅥB薄層色譜法（thin layer chromatography，TLC）試驗(yàn)要求，精密吸取上述3種溶液各10μL，分別點(diǎn)在同一硅膠G薄層色譜板上，將三氯甲烷－甲醇－乙酸乙酯－甲酸（40∶10∶5∶0．2）作為展開劑，展開，晾干，噴灑顯色劑5%的香草醛硫酸溶液適量，加熱直至斑點(diǎn)顏色顯示清晰。在供試品色譜圖中，與對(duì)照品色譜圖的對(duì)應(yīng)位置上，顯示相同顏色的藍(lán)紫色斑點(diǎn)，陰性對(duì)照溶液無干擾。結(jié)果見圖1。

2．2 澤瀉的鑒別［2］213取本品顆粒約2．0g，研成細(xì)粉，加入乙酸乙酯20mL，超聲波處理30min，濾過，將濾液加于氧化鋁柱（200～300目，5g，內(nèi)徑1cm，干法裝柱）上，用乙酸乙酯10mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)尤?mL乙酸乙酯使其溶解，作為供試品溶液。取23－乙酰澤瀉醇B對(duì)照品適量，加乙酸乙酯制成2mg／mL的溶液作為對(duì)照品溶液。取缺澤瀉提取物的陰性樣品同法制成陰性對(duì)照溶液；按照TLC法（《中華人民共和國藥典》2010年版一部ⅥB）試驗(yàn)，精密吸取上述3種溶液各10μL，分別點(diǎn)在同一硅膠H薄層板上，以乙酸乙酯－環(huán)己烷（1∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴灑顯色劑5%的硅鎢酸乙醇溶液適量，在105℃下加熱至斑點(diǎn)顏色顯示清晰。供試品色譜圖中，在與對(duì)照品色譜圖相應(yīng)位置上，顯示相同顏色的紅色斑點(diǎn)，陰性對(duì)照溶液無干擾。結(jié)果見圖2。

2．3 芍藥苷含量測定［6－10］

2．3．1 色譜條件 色譜柱為phenomenex C18（250 mm×4．6mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈－0．05%磷酸水溶液（14∶86）；流速：1．0mL／min；檢測波長：230nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20μL。理論塔板數(shù)按照芍藥苷的峰計(jì)算應(yīng)高于2 000，分離度應(yīng)不低于1．5。

2．3．2 對(duì)照品溶液制備 取經(jīng)干燥的芍藥苷對(duì)照品適量，精密稱取33．35mg，置于50mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制成0．667mg／mL的芍藥苷對(duì)照品貯備溶液。吸取對(duì)照品貯備溶液1mL置10mL量瓶中，加入甲醇至刻度，即得66．7μg／mL的芍藥苷對(duì)照品溶液。

2．3．3 供試品溶液的制備 取本品適量，研細(xì)，精密稱定0．5g，置50mL量瓶中，加甲醇至刻度，超聲提取30min，放冷，用甲醇補(bǔ)足缺失量，用0．45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2．3．4 陰性對(duì)照溶液 按制劑工藝制備處方中除去白芍的陰性對(duì)照樣品，照“2．3．3”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液。分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各20μL，按含量測定項(xiàng)下方法測定，色譜圖（見圖3）提示，在對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，供試品溶液具有相同保留時(shí)間的色譜峰，陰性對(duì)照在此峰位無吸收。

2．3．5 線性關(guān)系考察 分別精密量取芍藥苷對(duì)照品貯備溶液（0．667mg／mL）0．1、0．2、0．4、0．6、0．8、1．0mL，分別置2mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，過0．45μm微孔濾膜，制成系列對(duì)照品溶液。按“2．3．1”項(xiàng)下方法測定，以峰面積y對(duì)芍藥苷濃度x（μg／mL）進(jìn)行線性回歸，即得回歸方程：y＝29 505x－108 325，r＝0．999 1（n＝6）。結(jié)果表明，芍藥苷濃度在33．35～333．50μg／mL范圍內(nèi)與峰面積的線性關(guān)系良好。

2．3．6 精密度考察 精密量取芍藥苷對(duì)照品溶液20μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測得芍藥苷的峰面積，結(jié)果表明此方法的精密度良好（RSD＝1．20%）。

2．3．7 重復(fù)性考察 取相同批號(hào)樣品6份，按照“2．3．3”項(xiàng)下的方法制備樣品溶液，測得芍藥苷的峰面積，計(jì)算其平均含量為2．30%，RSD為1．98%（n＝6），表明該方法重復(fù)性良好。

2．3．8 穩(wěn)定性考察 取同一樣品溶液，分別于0、1、2、4、8、12h進(jìn)樣，測定芍藥苷峰面積，結(jié)果其RSD為2．0%，表明樣品溶液在12h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2．3．9 加樣回收率考察 稱取6份已知含量的樣品（批號(hào)121120）約0．1g，精密稱定，置50mL量瓶中，分別精密加入濃度0．667mg／mL對(duì)照品貯備溶液4mL，按照“2．3．3”項(xiàng)下方法操作，測定芍藥苷含量，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2．3．10 樣品含量測定 按“2．3．3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液（批號(hào)分別為121024、121120、121209），分別吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各20μL，注入高效液相色譜儀，按色譜條件測定峰面積，以外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算芍藥苷含量。結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果

3 討論

3．1 超聲時(shí)間的確定 在含量測定時(shí)，采用超聲提取法制備供試品溶液，對(duì)提取溶劑和超聲時(shí)間進(jìn)行考察，分別選擇甲醇、50%乙醇、70%乙醇、無水乙醇超聲30min，結(jié)果甲醇明顯優(yōu)于不同濃度乙醇；再分別以甲醇超聲提取20、30、40min，結(jié)果甲醇超聲提取30min與40min提取率相近，并高于20min，故選擇甲醇超聲提取30min。

3．2 流動(dòng)相的選擇 曾采用乙腈－水（14∶86）為流動(dòng)相，但存在明顯的拖尾現(xiàn)象，選用乙腈－0．05%磷酸（14∶86）作流動(dòng)相時(shí)，可改善拖尾現(xiàn)象，且峰型較好。因此，本實(shí)驗(yàn)選取乙腈－0．05%磷酸溶液（14∶86）為流動(dòng)相。

3．3 線性關(guān)系考察 芍藥苷濃度在33．35～333．5 μg／mL范圍內(nèi)與峰面積的線性關(guān)系良好（r＝0．999 1），不僅說明方法可靠，而且說明無論是用標(biāo)準(zhǔn)曲線還是用外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算含量，其結(jié)果區(qū)別不大，因此，在樣品測定中采用外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算芍藥苷含量，簡單準(zhǔn)確。

［1］王帆，桂雙英，王舉濤．正交試驗(yàn)法優(yōu)選復(fù)方白芍顆粒提取工藝［J］．安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，31（6）：71－73．

［2］國家藥典委員會(huì)．中華人民共和國藥典：一部［M］．北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：97，213．

［3］程巧鴛，陳碧蓮．明目地黃丸（濃縮丸）質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究［J］．中成藥，2012，34（6）：1091－1095．

［4］任愛農(nóng)，孔銘，田耀洲．清清顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究［J］．中成藥，2007，29（3）：456－458．

［5］王亞洲，楊春旭．蝎龍酒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究［J］．中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18（23）：105－108．

［6］李越峰，楊武亮，沈菲，等．高效液相色譜測定白芍中芍藥苷的含量［J］．時(shí)珍國醫(yī)國藥，2008，19（2）：438－439．

［7］梁秀瓊，鐘鏡金，李卓明，等．調(diào)經(jīng)丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究［J］．中藥新藥與臨床藥理，2007，18（5）：388－390．

［8］施鈞瀚，牛曉靜，孫明明．慢肝康丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究［J］．中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010，16（16）：42－44．

［9］郭煒，袁志芳，張?zhí)m桐．歸芍軟膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究［J］．中成藥，2006，28（3）：351－355．

［10］羅建明，李智勇．歸附調(diào)經(jīng)顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究［J］．中藥材，2011，34（8）：1295－1298．