王運(yùn)斌，江良榮，黃榮裕，黃育民，鄭景生

（廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建廈門361102）

隨著分子標(biāo)記技術(shù)的快速發(fā)展，聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）結(jié)合非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染技術(shù)已廣泛應(yīng)用于水稻遺傳連鎖圖譜構(gòu)建、基因定位克隆、分子標(biāo)記輔助育種、遺傳多樣性分析等研究領(lǐng)域，但非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳常規(guī)銀染法比較復(fù)雜、耗時費(fèi)力、成本高、效率低，不利于進(jìn)行大規(guī)模批量樣品材料分析或育種材料選擇。因此，許多研究者根據(jù)大規(guī)模分子標(biāo)記分析工作的實(shí)驗(yàn)需要，從減少操作步驟、減少顯帶時間、降低藥品成本、提高分辨率等方面對常規(guī)銀染法進(jìn)行了改進(jìn)[1-9]。研究基于本實(shí)驗(yàn)室長期應(yīng)用的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳常規(guī)銀染法[10]的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)和簡化銀染步驟，建立了一種高效節(jié)本的批量快速銀染法，能極大提高遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位、分子標(biāo)記輔助育種等大規(guī)模樣品分子標(biāo)記分析檢測的效率，大幅度減少檢測成本。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料為隨機(jī)選取的水稻“航2號”與“象牙香占”雜交建立的BC3F2分離群體部分單株分蘗期葉片。引物為王豐等[11]設(shè)計(jì)開發(fā)的InDel功能標(biāo)記GRFM04。DNA提取參考王蘭等[12]的基因組DNA快速制備方法。

1.2 PCR反應(yīng)體系和程序

PCR反應(yīng)體系總體積為11 μL，其中10×buffer1.1 μL，2.5 mmol/LdNTPs 0.8 μL，5 U/μLTaq酶 0.1 μL，正反引物各0.05 μL，DNA模板 1 μL，ddH2O 7.9 μL。

PCR反應(yīng)在Biometra Tprofessional Thermocycler PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸2 min，35個循環(huán)，最后72℃延伸5 min，4℃保存。

1.3 PCR產(chǎn)物的電泳分離

PCR產(chǎn)物采用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，具體參考鄭景生等[10]的方法，采用垂直電泳槽電泳，每塊凝膠的大小約為長12.5 cm、高18 cm、厚1.0 mm，電泳條件為電壓340V電泳2 h左右，然后采用常規(guī)銀染法和改進(jìn)銀染法進(jìn)行染膠并照相保存。

1.4 銀染方法

電泳結(jié)束后取下膠板，分別按下述銀染方法各染1塊凝膠，染色液各為100 mL，所用染膠盤的規(guī)格為長20 cm、寬30 cm、高5.5 cm的搪瓷盤，記錄染色時間（不包括剝膠時間）。

1.4.1 非變性聚丙烯酰胺凝膠常規(guī)銀染方法 ①固定：90 mL蒸餾水加入10 mL乙醇，放入凝膠，加500 μL冰乙酸，搖動3 min；②染色：加入1 mL20%的硝酸銀溶液，搖動5～8 min；③漂洗：倒掉染色液，蒸餾水漂洗2～3次，洗凈后，倒掉蒸餾水；④顯影：在染膠盤中加入100 mL 3%NaOH溶液 （100 mL蒸餾水+3 g NaOH） 和500 μL甲醛，迅速震蕩，使顯影液均勻作用，放入凝膠顯影3～5 min；⑤洗滌：顯影后，倒掉顯影液，用蒸餾水漂洗2～3次；⑥顯影后的凝膠平置于玻璃板上，記錄PCR產(chǎn)物帶型；晾干后可進(jìn)行拍照，亦可覆蓋保鮮膜長久保存。

1.4.2 非變性聚丙烯酰胺凝膠銀染方法改進(jìn)一 ①固定染色：染膠盤中加入100 mL蒸餾水和500 μL20%硝酸銀溶液，放入凝膠，搖動8～10 min；②漂洗：倒掉染色液，用蒸餾水漂洗2～3次；③顯影：在染膠盤中加入100 mL 0.5%NaOH溶液（100 mL蒸餾水+0.5 g NaOH）、0.019 g四硼酸鈉和400 μL甲醛，迅速震蕩，使顯影液充分作用，搖動3～5 min；④洗滌：顯影后，倒掉顯影液，用蒸餾水漂洗2～3次；⑤顯影后的凝膠平置于玻璃板上，記錄PCR產(chǎn)物帶型；晾干后可進(jìn)行拍照，亦可覆蓋保鮮膜長久保存。

1.4.3 非變性聚丙烯酰胺凝膠銀染方法改進(jìn)二 ①固定染色：染膠盤中加入100 mL蒸餾水和500 μL20%硝酸銀溶液，放入凝膠，搖動8～10 min；②顯影：加入0.5 g NaOH、0.019 g四硼酸鈉以及400 μL甲醛溶液，搖動3～5 min；③洗滌：顯影后，倒掉顯影液，用蒸餾水漂洗2～3次；④顯影后的凝膠平置于玻璃板上，記錄PCR產(chǎn)物帶型；晾干后可進(jìn)行拍照，亦可覆蓋保鮮膜長久保存。

1.4.4 非變性聚丙烯酰胺凝膠銀染方法改進(jìn)三 ①固定染色：染膠盤中加入100 mL蒸餾水和500 μL20%硝酸銀溶液，放入凝膠，搖動8～10 min；②顯影：加入0.5 g NaOH以及400 μL甲醛溶液，搖動3～5 min；③洗滌：顯影后，倒掉顯影液，用蒸餾水漂洗2～3次；④顯影后的凝膠平置于玻璃板上，記錄PCR產(chǎn)物帶型；晾干后可進(jìn)行拍照，亦可覆蓋保鮮膜長久保存。

1.4.5 非變性聚丙烯酰胺凝膠銀染方法改進(jìn)四 ①固定染色：染膠盤中加入100 mL蒸餾水和500 μL20%的硝酸銀溶液，放入凝膠，搖動8～10 min；②漂洗：倒掉染色液，用蒸餾水漂洗2～3次；③顯影：在染膠盤中加入100 mL 0.5% NaOH溶液（100 mL蒸餾水+0.5 g NaOH）和400 μL甲醛，迅速震蕩，使顯影液充分作用，搖動3～5 min；④洗滌：顯影后，倒掉顯影液，用蒸餾水漂洗2～3次；⑤顯影后的凝膠平置于玻璃板上，記錄PCR產(chǎn)物帶型；晾干后可進(jìn)行拍照，亦可覆蓋保鮮膜長久保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同銀染方法的染色效果

不同非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染方法的染色效果見圖1～5，看出：常規(guī)銀染法（圖1）與改進(jìn)銀染法一（圖2）、改進(jìn)銀染法四（圖5）的膠片背景比較清晰，分辨率高，條帶容易分辨，能準(zhǔn)確判斷帶型；改進(jìn)銀染法二（圖3）與改進(jìn)銀染法三（圖4）的膠片背景比較模糊，分辨率較低，表面存在成片的白色物質(zhì)，較難準(zhǔn)確判斷帶型。

圖1 常規(guī)銀染方法的染色效果

圖2 銀染改進(jìn)方法一的染色效果

圖3 銀染改進(jìn)方法二的染色效果

圖4 銀染改進(jìn)方法三的染色效果

圖5 銀染改進(jìn)方法四的染色效果

2.2 不同銀染方法的優(yōu)缺點(diǎn)

不同非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染方法染1塊凝膠的染色液用量均為100 mL，染色時間基本相近（表1），但操作步驟、試劑用量有所不同（表 2）。

從表1看出，常規(guī)銀染方法的操作繁瑣、染色時間較長，全程約需16.5 min。銀染改進(jìn)方法一與銀染改進(jìn)方法四簡化步驟，將固定和染色兩步驟合并，簡化操作，染色時間約需16 min。銀染改進(jìn)方法二與銀染改進(jìn)方法三的銀染步驟更加簡化，除將固定和染色兩步驟合并外，還省去了漂洗步驟，操作更加簡便，染色時間最短，約需15 min?？梢姡y染改進(jìn)方法簡化了操作步驟、縮短了染色時間，有利于提高工作效率。

表1 不同銀染方法的染色時間

表2顯示，常規(guī)銀染方法所消耗的試劑最多，銀染改進(jìn)方法的各種試劑用量大幅度減少。與常規(guī)銀染方法相比，銀染改進(jìn)方法省去了無水乙醇與冰乙酸的使用，硝酸銀、氫氧化鈉和甲醛的用量分別減少1/2、5/6、1/5，實(shí)驗(yàn)成本大幅度降低，減少醋酸、甲醛等刺鼻氣味對人體健康的影響，減少廢棄液對環(huán)境的污染。但銀染改進(jìn)方法一和銀染方法二又增加了四硼酸鈉的使用，也相應(yīng)增加了實(shí)驗(yàn)成本。

如在染色過程中，硝酸銀是最重要的試劑，其價格昂貴，一瓶規(guī)格為25 g的硝酸銀（上海生工）價格為226元，配制成20%硝酸銀溶液為125 mL，若按表2的硝酸銀使用劑量來計(jì)算，常規(guī)銀染方法只能染膠125塊，每塊膠的硝酸銀成本約1.8元，但銀染改進(jìn)方法均可染膠250塊，每塊膠的硝酸銀成本約0.9元，為常規(guī)銀染方法的一半。此外，銀染改進(jìn)方法不再需要無水乙醇和冰乙酸，同時減少了氫氧化鈉和甲醛的使用量。

由此可見，銀染改進(jìn)方法不僅節(jié)省大量成本，而且減少了對人體和環(huán)境的影響。綜合以上結(jié)果分析，認(rèn)為銀染改進(jìn)方法四是本研究中最佳的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染法。

表2 不同銀染方法的試劑使用量

3 討論

目前大多數(shù)的分子標(biāo)記遺傳連鎖圖譜構(gòu)建、基因定位克隆、分子標(biāo)記輔助育種、DNA指紋分析等研究涉及的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物多數(shù)采用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染確定，其染色膠片的質(zhì)量對條帶的準(zhǔn)確統(tǒng)計(jì)、結(jié)果分析非常重要。若膠片背景模糊、條帶不易辨別判斷，很容易導(dǎo)致統(tǒng)計(jì)結(jié)果錯誤，進(jìn)而影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。此外，傳統(tǒng)的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染方法操作繁瑣、耗時費(fèi)力、成本高、效率低，難以大批量操作，不利于進(jìn)行大規(guī)模批量樣品材料分析或育種材料選擇，影響實(shí)驗(yàn)進(jìn)展。因此，實(shí)驗(yàn)室對非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳常規(guī)銀染方法進(jìn)行改進(jìn)，篩選出在不影響染膠效果的基礎(chǔ)上可進(jìn)行大批量銀染、大幅度降低實(shí)驗(yàn)成本的銀染方法。

研究結(jié)果表明，5種非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染方法中銀染改進(jìn)方法二和銀染改進(jìn)方法三的染色膠片背景較為模糊、帶型不易辨別，不宜采用。常規(guī)銀染方法、銀染改進(jìn)方法一和銀染改進(jìn)方法四的染色膠片背景清晰、條帶清楚易于辨別，但常規(guī)銀染方法的操作繁瑣、消耗試劑多、成本高，而銀染改進(jìn)方法一比銀染改進(jìn)方法四有增加了四硼酸鈉的使用。因而，研究認(rèn)為，銀染改進(jìn)方法四是最佳的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染法，具有操作簡便、實(shí)驗(yàn)成本低、膠片背景清晰、條帶清楚等特點(diǎn)，值得推廣。

為加快實(shí)驗(yàn)進(jìn)程、提高工作效率，在實(shí)際操作過程中，實(shí)驗(yàn)室習(xí)慣采用批量銀染方法，即每批次可染膠2～20塊，可大幅度提高染膠效率。本實(shí)驗(yàn)室常用的批量銀染方法是，采用上述的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染改進(jìn)方法四，當(dāng)染膠數(shù)量為10～20塊時，試劑和染色液的用量均減半，即只需按染膠數(shù)量的一半來配制染色液數(shù)量。如要染膠10塊，則只需配制5塊膠的染色液數(shù)量500 mL即可滿足需要，而染膠效果基本不受影響。因此，批量銀染可大幅度節(jié)約試劑、降低成本、縮短時間、加快實(shí)驗(yàn)進(jìn)度，提高實(shí)驗(yàn)效率，取得事半功倍的效果。

[1]王鳳格，趙久然，郭景倫，等.一種改進(jìn)的玉米SSR標(biāo)記的PAGE/快速銀染檢測新方法[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2004，12（5）：606-607.

[2]宋顯軍，張 偉，曹萍，等.大豆SSR標(biāo)記PAGE銀染方法的改進(jìn)[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，34（16）：3922-3923.

[3]關(guān)海濤，徐世昌，郭玉華.兩種聚丙烯酰胺凝膠銀染方法的比較[J].沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，37（1）：86-87.

[4]梁宏偉，王長忠，李忠，等.聚丙烯酰胺凝膠快速、高效銀染方法的建立[J].遺傳，2008，30（10）：1379-1382.

[5]胡建斌，李靜，袁鳴，等.PAGE凝膠制備方法和銀染方法的改進(jìn)[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào).2009，31（4）：742-745.

[6]高東，杜飛，朱有勇.低背景、高分辨率PAGE簡易銀染法[J].遺傳，2009，31（6）：668-673.

[7]蔡輝儒，李憶，蒲志剛，等.一種簡易銀染程序的確定與優(yōu)化[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009（1）：46-48.

[8]王竹林，楊睿，劉聯(lián)正，等.聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染的影響因素[J].實(shí)驗(yàn)室研究與探索，2011，30（9）：15-17.

[9]靳容，后猛，馬代夫，等.甘薯AFLP擴(kuò)增產(chǎn)物的PAGE 膠快速銀染法[J].江蘇 農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（2）：30-32.

[10]鄭景生，呂蓓.PCR 技術(shù)及實(shí)用方法[J].分子植物育種，2003，1（3）：381-394.

[11]王豐，李金華，柳武革，等.一種水稻香味基因功能標(biāo)記的開發(fā)[J].中國水稻科學(xué)，2008，22（4）：347-352.

[12]王蘭，龍?jiān)沏懀瑒⒁?一種用于PCR的植物基因組 DNA 快速制備方法[J].分子植物育種，2009，7（2）：425-428.