謝碧秀，馬建英，劉 滕，何 強(qiáng)，楊澤身，朱華榮

(1．眉山職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川眉山 620020;2．涼山州中澤新技術(shù)開發(fā)有限責(zé)任公司，四川西昌 615000)

油橄欖(Olea europaea L．)又名洋橄欖、齊敦果，在植物分類上屬于木犀科木犀欖屬，屬常綠喬木，原產(chǎn)小亞細(xì)亞［1］，經(jīng)希臘擴(kuò)展到地中海沿岸地區(qū)栽培已有4 000年的歷史［2］，在我國油橄欖主要分布在甘肅、廣東、廣西、云南、四川等省區(qū)［3］。油橄欖全身都是寶，其果實(shí)含油量可高達(dá) 40．07%［4］，而橄欖油是食用植物油中少有的未經(jīng)提煉的，其含有固醇類、維生素、多酚等生物活性物質(zhì);油橄欖果榨油后產(chǎn)生的果渣及廢水富含三萜類、黃酮類、多酚類物質(zhì)，油橄欖葉富含橄欖苦苷、羥基酪醇、山楂酸、黃酮等抗氧化物［3］。多酚類化合物是指分子結(jié)構(gòu)中有若干個(gè)酚性羥基的植物成分的總稱，廣泛存在于許多植物中，多酚的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)使其具有較強(qiáng)的抗氧化以及清除自由基的能力。

1 多酚的含量特點(diǎn)

油橄欖中多酚的含量受諸多因素的影響，不同季節(jié)、樹齡、品種、植株部位以及原料預(yù)處理方式都會(huì)影響多酚的含量。

1．1 季節(jié)對(duì)多酚含量的影響 油橄欖生長發(fā)育過程中的各種內(nèi)部生理因素是影響其葉片中多酚含量變化的重要因素，比如開花、結(jié)果、抽枝、冬眠等生理作用對(duì)其植株各部位葉片多酚含量影響極為顯著。同時(shí)，光照、溫度、水分等氣象因子會(huì)影響植物的生長發(fā)育和多酚類物質(zhì)的積累。不同品種油橄欖葉片多酚含量從春季到冬季都呈逐漸減少的趨勢(shì)［2］，葉片多酚含量均以2、3 月份較高，10、11 月份達(dá)到最低［5］。

1．2 樹齡對(duì)多酚含量的影響 幼齡植株生長旺盛，合成代謝大于分解代謝，而老樹齡的剛好相反，幼齡植株的多酚含量比老樹齡的高。高彩霞等研究發(fā)現(xiàn)，不同樹齡油橄欖葉中多酚含量相差較大，3年生油橄欖葉中多酚的含量高達(dá)11．30%，而20 年以上樹齡的油橄欖葉僅為 5．14%［6］。

1．3 品種對(duì)多酚含量的影響 多酚類物質(zhì)在植物體中的合成受遺傳因素的影響，不同品種油橄欖中多酚含量差異很大。耿樹香等以云南引種的16個(gè)品種油橄欖葉樣及13個(gè)品種的果渣樣為原料，測(cè)定其中多酚物質(zhì)的含量發(fā)現(xiàn)，葉樣多酚含量鄂植8號(hào)中的最低，為1．02%，城固53中最高，為8．29%;果渣樣品中多酚含量，阿斯最低，為0．64%，而萊星最高，為1．56%［7］。高彩霞對(duì)阿斯、萊星、皮削利3個(gè)品種油橄欖葉中多酚的含量進(jìn)行了比較研究，其最高含量分別為9．72% 、9．39%、7．58%［5］。

1．4 植株部位對(duì)多酚含量的影響 多酚類物質(zhì)及其前體物質(zhì)的合成代謝頻道分布在植物不同的器官、組織、細(xì)胞或細(xì)胞內(nèi)不同的細(xì)胞器內(nèi)，其合成部位和積累部位不同，因而多酚的含量在同一植株的不同器官中是有差異的。耿樹香等研究發(fā)現(xiàn)，油橄欖葉樣中多酚含量平均值(4．21%)大于果渣中多酚平均含量(1．10%)［7］。這說明油橄欖中的多酚可能是由葉片合成，并輸送到果實(shí)中去的，但多數(shù)仍然存在于葉片中。

1．5 原料預(yù)處理方式對(duì)多酚含量的影響 新鮮橄欖果榨油后，果實(shí)被破壞，其所含有的多酚與空氣接觸很快被氧化，若不立即進(jìn)行提取測(cè)定或者不立即進(jìn)行真空包裝，其含量將會(huì)產(chǎn)生差異。不同的干燥方式對(duì)多酚的含量影響也很大，多酚類化合物中有些物質(zhì)對(duì)光不穩(wěn)定，長期在太陽光下照射，易分解，從而使樣品中多酚含量下降。高彩霞等研究發(fā)現(xiàn)，陰干樹葉中多酚的含量較曬干的多，20年生大樹葉，自然陰干的為5．14%，太陽曬干的為2．78%;3年生的小樹葉，自然陰干的為11．30%，太陽曬干的為 6．90%［5］。

2 提取分離

2．1 提取

2．1．1 加熱回流提取?；亓魈崛》ㄊ怯靡掖嫉纫讚]發(fā)的有機(jī)溶劑提取原料成分，將浸出液加熱蒸餾，其中揮發(fā)性溶劑餾出后又被冷卻，重復(fù)流回浸出容器中浸提原料，這樣周而復(fù)始，直至有效成分回流提取完全的方法。根據(jù)多酚類化合物的極性特點(diǎn)，常用甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等作為溶劑，進(jìn)行提取;多酚類化合物易氧化分解，因而提取溫度不宜太高，提取時(shí)間不宜過長。饒俞等采用乙醇溶劑浸提法提取廣元地區(qū)油橄欖葉多酚物質(zhì)，在料液比1∶35 g/ml，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，浸提溫度55℃，浸提時(shí)間1．75 h的條件下，油橄欖葉多酚提取量為 57．22 mg/g［8］。

2．1．2 微波輔助提取。由于微波加熱是高頻電磁波穿透萃取介質(zhì)到達(dá)物料內(nèi)部使其溫度迅速上升導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)部壓力超過細(xì)胞壁膨脹所能承受的壓力，結(jié)果細(xì)胞破碎，使細(xì)胞液溢出并擴(kuò)散至溶劑中，從而加快了萃取速率，微波輔助提取方法具有穿透力和選擇性強(qiáng)、加熱效率高、操作方法簡單、清潔高效等優(yōu)點(diǎn)［9］。耿樹香等采用微波輔助法提取了油橄欖葉樣及果渣樣中多酚物質(zhì)［7］;孔維寶等也利用微波輔助技術(shù)提取油橄欖果渣，多酚含量可達(dá)1．02%，得率比常規(guī)溶劑提取方法提高18% ～38%［10］。

2．1．3 超聲波提取。超聲波提取是利用超聲產(chǎn)生的強(qiáng)烈振動(dòng)和空化效應(yīng)，加速植物細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的釋放、擴(kuò)散并溶解到溶液中，從而達(dá)到分離的目的，具有提取效率高、提取時(shí)間短、提取溫度低、適應(yīng)性廣、提取液雜質(zhì)少、提取工藝運(yùn)行成本低、操作簡單易行、綜合效益顯著等優(yōu)點(diǎn)。夏俊雅等使用甲醇為溶劑，采用超聲波法提取油橄欖葉中多酚的最佳條件為:溫度30℃，超聲功率125 W，料液比1∶125 g/ml，提取時(shí)間1 h，粉末連續(xù)提取2 次［11］。

2．2 分離

2．2．1 柱層析法。多酚類物質(zhì)溶于水、醇等溶劑中，在測(cè)定時(shí)很難用溶劑提取等一般分離方法使其與粗提液中水溶性雜質(zhì)分開。大孔樹脂吸附特別適合水溶性化合物純化分離。該法具有吸附容量大、選擇性好、易于解吸、機(jī)械強(qiáng)度高、再生處理簡單、操作簡單、得率恒定、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定、成本低等特點(diǎn)，且吸附法僅用少量溶媒洗脫樹脂就能達(dá)到濃縮目的，但耗用時(shí)間長，吸附樹脂清洗困難［12］。高彩霞等用D101大孔樹脂吸附多酚類物質(zhì)，精制后的提取物中多酚含量達(dá)87．3%［6］。

2．2．2 反相中壓制備液相色譜法。液相色譜法是基于混合物中各組分對(duì)兩相親和力的差別，從而達(dá)到分離的目的。反相色譜法是以表面非極性載體為固定相，以比固定相極性強(qiáng)的溶劑為流動(dòng)相的一種液相色譜分離模式，其固定相大多是硅膠表面鍵合疏水基團(tuán)，基于樣品中的不同組分和疏水基團(tuán)之間疏水作用的不同而分離。反相液相色譜柱效高、分離能力強(qiáng)、保留機(jī)理清楚，是液相色譜分離模式中使用最為廣泛的一種。夏俊雅等采用反相中壓制備液相色譜技術(shù)從油橄欖葉中分離多酚類物質(zhì)，通過DAC-HB動(dòng)態(tài)軸向壓縮柱進(jìn)行第一次分離，共得到8個(gè)組分。在此基礎(chǔ)上，對(duì)第1次制備得到的組分進(jìn)行第2次制備，共分離純化得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高的5 種多酚類物質(zhì)［13］。

2．3 含量測(cè)定 測(cè)定多酚含量的方法主要有Folin-Ciocalteu法、酒石酸鐵法、紫外分光光度法等。

2．3．1 Folin-Ciocalteu 法。Folin-Ciocalteu比色法是 Folin-Denis法的改進(jìn)方法，F(xiàn)olin-Ciocalteu試劑中的鎢鉬酸可以將多酚類化合物定量氧化，自身被還原(使W6+變?yōu)閃5+)生成藍(lán)色的化合物，顏色的深淺跟多酚含量成正相關(guān)，因此可以通過在765 nm處測(cè)定吸光值來對(duì)多酚進(jìn)行定量［14］。該法測(cè)得的除了多酚類物質(zhì)，也包括含有酚羥基基團(tuán)的物質(zhì)及具有還原能力的抗壞血酸［15－16］。

2．3．2 酒石酸鐵法。酒石酸鐵法是測(cè)多酚類物質(zhì)的總含量，是利用Fe2+與多酚類物質(zhì)絡(luò)合形成藍(lán)色物質(zhì)，在540 nm波長處有最大吸收峰［16－17］，但因該法測(cè)得的僅是多酚類物質(zhì)，且不同多酚類化合物對(duì)酒石酸鐵呈色能力不同，因而測(cè)得多酚的含量低于 Folin-Ciocalteu 比色法［18，16］。

2．3．3 紫外分光光度法。紫外分光光度法是根據(jù)酚類物質(zhì)在紫外區(qū)有吸收光譜的原理，直接通過光譜掃描測(cè)定多酚含量［19，16］。其中，紫外分光光度法測(cè)定的不僅是所有酚類物質(zhì)的含量，還包括帶有酚羥基基團(tuán)的物質(zhì)［20，16］。

2．3．4 高效液相色譜法。夏俊雅等建立了HPLC法同時(shí)測(cè)定油橄欖葉抗糖尿病有效部位中的5種多酚類化合物含量:脫咖啡?；锾擒?．426 1 mg/g、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷 1．633 mg/g、6″-O-β-D-吡喃葡萄糖 － 橄欖苦苷 0．809 3 mg/g、裂環(huán)馬錢子苷 3．847 mg/g、橄欖苦苷 48．94 mg/g［11］。

3 分析鑒定

3．1 核磁共振法 核磁共振波譜法是研究處于強(qiáng)磁場(chǎng)中的原子核對(duì)射頻輻射吸收后引起核自旋能級(jí)的躍遷所產(chǎn)生的波譜，從而獲得有關(guān)化合物分子結(jié)構(gòu)信息的分析方法。王曉飛等采用核磁共振分別對(duì)從油橄欖葉醋酸乙酯部位中分離得到的15個(gè)多酚類化合物進(jìn)行鑒定，分別為酪醇、羥基酪醇、羥基酪醇乙酰酯、1H-2-苯并吡喃-6，7-二醇、3，4-二羥基苯甲酸、3-羥基-4-甲氧基苯甲酸、異鼠李素、圣草酚、花旗松素、槲皮素、木犀草素、女貞苷、橄欖苦苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、木犀草素-7-O-葡萄糖苷［21］。

夏雅俊等采用核磁共振法對(duì)通過中壓制備色譜法從油橄欖葉中分離出的5個(gè)組分進(jìn)行鑒定，均為多酚類化合物［13］。

3．2 質(zhì)譜法 質(zhì)譜法即用電場(chǎng)和磁場(chǎng)將運(yùn)動(dòng)的離子(帶電荷的原子、分子或分子碎片，有分子離子、同位素離子、碎片離子、重排離子、多電荷離子、亞穩(wěn)離子、負(fù)離子和離子－分子相互作用產(chǎn)生的離子)按它們的質(zhì)荷比分離后進(jìn)行檢測(cè)的方法。王百川等建立了國產(chǎn)油橄欖葉中酚類化合物的超高壓液相色譜－飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC/Q-TOF-MS)定性分析方法，采用該方法得到了國產(chǎn)油橄欖葉提取物的紫外檢測(cè)的色譜圖、負(fù)離子監(jiān)測(cè)的總離子流圖以及一級(jí)質(zhì)譜圖，成功鑒定了國產(chǎn)油橄欖葉中的15種酚類化學(xué)成分［22］。

4 生物活性

油橄欖多酚物質(zhì)作為一類氧化還原電位很低的還原劑，具有很強(qiáng)供氫能力，H+與羥基自由基結(jié)合，能使之還原為惰性化合物或較穩(wěn)定的自由基，從而清除人體內(nèi)過多的有害自由基，在人體中可通過抑制低密度脂蛋白的氧化有助于防止冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生［7，23］。王昱等研究發(fā)現(xiàn)，油橄欖葉提取物能對(duì)海洛因造成的肺損害起到保護(hù)作用［24］，對(duì)鉛中毒小鼠有一定的療效，能減輕鉛中毒引起的海馬脂質(zhì)過氧化損傷［25］，能影響肌肉組織 DNA 甲基化水平［26］、視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)［27］、脾臟和胸腺細(xì)胞周期進(jìn)程［28－29］、抗氧化能力，阻止鉛對(duì)肌肉、視網(wǎng)膜、脾臟和胸腺的毒害作用，能改善染鉛小鼠的腎功能［30］。

5 前景與展望

我國甘肅隴南、四川廣元和西昌大力推廣油橄欖種植，但缺乏除橄欖油外其他產(chǎn)品的深加工，油橄欖葉及榨油所產(chǎn)生的果渣和廢液不僅沒有得到充分利用，還造成了環(huán)境污染。因此研究適于工業(yè)化提取純化油橄欖多酚類物質(zhì)的方法，最大限度地發(fā)揮資源優(yōu)勢(shì)，開發(fā)以油橄欖多酚為主要原料的產(chǎn)品，對(duì)于滿足市場(chǎng)需求，提高油橄欖的深加工水平，創(chuàng)造極為顯著的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益具有深遠(yuǎn)意義。

［1］王貴禧，俞寧，鄧明全，等．中國油橄欖發(fā)展概況［J］．林業(yè)科技通訊，2000(1):32－34．

［2］梁劍．三種油橄欖葉片中多酚含量的季節(jié)動(dòng)態(tài)變化研究［J］．北方園藝，2010(1):57－59．

［3］王成章，陳強(qiáng)，羅建軍，等．中國油橄欖發(fā)展歷程與產(chǎn)業(yè)展望［J］．生物質(zhì)化學(xué)工程，2013，47(2):41 －46．

［4］梁劍，蘇光燦，王自生．四種油橄欖品種部分果實(shí)品質(zhì)比較［J］．北方園藝，2009(3):91－93．

［5］高彩霞．油橄欖葉抗氧化物有效成分及其含量變化規(guī)律研究［D］．北京:中國林業(yè)科學(xué)研究院，2007．

［6］高彩霞，王成章，陳文英，等．油橄欖葉中多酚和黃酮的含量分析［J］．生物質(zhì)化學(xué)工程，2006，40(4):4 －6．

［7］耿樹香，寧德魯，李勇杰，等．微波輔助提取不同品種油橄欖葉及果渣多酚物質(zhì)［J］．西部林業(yè)科學(xué)，2014，43(4):27 －30．

［8］饒瑜，焦士蓉，龔麗，等．廣元地區(qū)油橄欖葉多酚提取條件及抗氧化活性研究［J］．西華大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2013，32(5):96 －99．

［9］楊俊江，郭錦棠．中草藥的不同提取方法與強(qiáng)化傳質(zhì)機(jī)理研究［J］．化工進(jìn)展，2002，21(9):660 －662．

［10］孔維寶，李陽，白萬明，等．微波輔助提取油橄欖果渣多酚［J］．食品與發(fā)酵工業(yè)，2011，37(4):233 －237．

［11］夏俊雅，孫小明，張佳，等．HPLC法同時(shí)測(cè)定油橄欖葉中的5種多酚類化合物含量［J］．分析實(shí)驗(yàn)室，2014，3(7):766 －770．

［12］鄭虎占，黃澤宏，佘靖．中藥現(xiàn)代化研究與應(yīng)用［M］．北京:學(xué)苑出版社，1998:2938 －2956．

［13］夏雅俊，劉永峰，裴棟，等．中壓制備色譜法分離制備油橄欖葉中多酚類化合物［J］．中草藥，2014，45(12):1689 －1692．

［14］何志勇，夏文水．Folin-Cilcalteu比色法測(cè)定橄欖中多酚含量的研究［J］．林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2006，26(4):15 －18．

［15］ROBBINS R J，BEAN S R．Development of a quantitative high-performance liquid chromatography-photodiode array detection measurement system for phenolic acids［J］．Journal of Chromatography A，2004，1038(1):97－105．

［16］謝倩，王威，陳清西．橄欖多酚含量測(cè)定方法的比較［J］．食品科學(xué)，2014，35(8):204 －207．

［17］黃皓，涂云飛，孫艷娟．兩種方法測(cè)定茶葉中茶多酚含量的比較［J］．中國茶葉加工，2009(2):43－44．

［18］陳惠衡，施玲，劉芳，等．酒石酸鐵比色法和Folin-Denis法測(cè)定茶多酚的比較［J］．中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2009，42(4):272 －274．

［19］張麗瑩．紫外分光光度法測(cè)定水中酚［J］．光譜實(shí)驗(yàn)室，2006，23(4):890 －892．

［20］卜彥花，周娜娜，王春悅，等．福林酚試劑法和紫外分光光度法測(cè)定冬棗多酚含量的比較研究［J］．中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2012，28(1):212 －217．

［21］王曉飛，李辰，鄭媛媛，等．油橄欖葉多酚類成分研究［J］．中草藥，2011，42(5):848 －851．

［22］王百川，付紹平，王丹，等．超高壓液相色譜－飛行時(shí)間質(zhì)譜法分析過程油橄欖葉中酚類化合物［J］．食品科學(xué)，2011，32(18):225 －229．

［23］ZARZUELO A，DUARTE J，JIMENEZ J，et al．Vasodilator effectof olive leaf［J］．Planta Med，1991，57(5):417 －419．

［24］王昱，王勝青．油橄欖葉提取物對(duì)海洛因依賴小鼠肺組織結(jié)構(gòu)及IL-1 β 和TNT-α 表達(dá)的影響［J］．甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，49(6):19－24．

［25］王昱．油橄欖葉提取物對(duì)鉛中毒小鼠大腦海馬組織抗氧化酶及NO與NOS 的影響［J］．甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，47(2):21 －24．

［26］王昱．油橄欖葉提取物對(duì)鉛中毒小鼠肌肉組織DNA甲基化水平及抗氧化能力的影響［J］．西北民族大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2012，33(4):47－50．

［27］王昱．油橄欖葉提取物對(duì)鉛中毒小鼠視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)及抗氧化能力的影響［J］．四川動(dòng)物，2013，32(3):429 －433．

［28］王昱．油橄欖葉提取物對(duì)鉛中毒小鼠脾臟的保護(hù)作用［J］．甘肅高師學(xué)報(bào)，2014，19(2):34 －36．

［29］王昱．油橄欖葉提取物對(duì)鉛中毒小鼠胸腺的影響［J］．德州學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，29(2):41 －44．

［30］王昱．油橄欖葉提取物對(duì)染鉛中小鼠腎功能的影響［J］．甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，48(6):23 －28．