蘇鵬，樊斌琦，王焱，張?jiān)婪?，郝德?/p>

(1．南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，江蘇 南京 210037;2．松江區(qū)林業(yè)站，上海 201613;3．上海市林業(yè)總站，上海 201613)

劉氏短須螨Brevipalpus lewisi McGregor屬真螨目Acariformes細(xì)須螨科Tenuipalpidae短須螨屬Brevipalpus，在我國(guó)危害葡萄Vitis vinifera、連翹Forsythia suspensa、忍冬Lonicera japonica、紫丁香Syringa oblata、爬山虎Parthenocissus tricuspidata等多種經(jīng)濟(jì)植物和觀賞植物［1］，在美洲、澳洲等地則是柑橘Citrus reticulata的重要害螨［2-3］。自2007年首次在上海發(fā)現(xiàn)劉氏短須螨危害水杉Metasequoia glyptostroboides以來(lái)，陸續(xù)在江蘇、安徽、浙江、湖北等省發(fā)現(xiàn)該螨危害水杉。水杉樹形優(yōu)美，樹干通直高大，生長(zhǎng)迅速，為亞熱帶平原地區(qū)優(yōu)良的綠化、行道樹種［4-5］。水杉受劉氏短須螨危害后，葉片明顯呈現(xiàn)黃褐色，遠(yuǎn)看如同火燒狀，正常生長(zhǎng)和園林綠化效果受到影響。由于水杉多用于行道樹和庭院綠化，因此防治時(shí)應(yīng)選用高效、低毒、低殘留的藥劑。雖然曾進(jìn)行過(guò)防治劉氏短須螨化學(xué)藥劑的藥效試驗(yàn)，但是多數(shù)藥劑仍為傳統(tǒng)的化學(xué)農(nóng)藥［6］。本研究選擇4種生物藥劑開(kāi)展室內(nèi)毒力測(cè)定，并測(cè)定了苦參堿對(duì)劉氏短須螨相關(guān)代謝酶活性的影響，以期篩選出適宜的藥劑及最佳濃度，為生產(chǎn)上有效控制劉氏短須螨危害提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料供試的劉氏短須螨采自南京林業(yè)大學(xué)校園水杉行道樹。帶回實(shí)驗(yàn)室后，在溫度(25±1)℃、相對(duì)濕度65%±10%、光周期14L∶10D條件下，用采自校園內(nèi)健康的水杉葉片飼養(yǎng)，取羽化的第2代成螨用于試驗(yàn)。供試藥劑為0．3%苦參堿水劑(陜西國(guó)豐化工有限公司)、0．5%印楝素懸浮劑(山東惠民中農(nóng)作物保護(hù)有限責(zé)任公司)、8000 IU/mg蘇云金桿菌(Bt)懸浮劑(衡陽(yáng)萊德生物藥業(yè)有限公司)和1．8%阿維菌素乳油(河北益海安格諾農(nóng)化有限公司)。過(guò)氧化物酶(POD)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)和乙酰膽堿酯酶(AchE)的酶活測(cè)定試劑盒由南京建成生物工程研究所生產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 毒力測(cè)定 將供試藥劑分別稀釋成400，600，800，1000倍液4個(gè)濃度梯度，采用玻片浸漬法測(cè)定。把雙面膠帶剪成l cm×2 cm大小，貼在載玻片的1端，選擇健康的劉氏短須螨成螨，用零號(hào)毛筆輕輕挑起并將其背部粘在膠帶上，保持足、口器及須肢可自由活動(dòng)，每張玻片30頭螨，排成5排，每排6頭。將粘有成螨的載玻片放在直徑15 cm的培養(yǎng)皿內(nèi)(皿內(nèi)放1塊濕潤(rùn)的脫脂棉)，置于25℃下，4 h后在雙目解剖鏡下檢查，挑除死亡個(gè)體并補(bǔ)足活成螨30頭。然后把粘有成螨的玻片置于藥液內(nèi)浸漬5 s后取出，用濾紙吸除載玻片和螨體周圍的多余藥液，移入培養(yǎng)皿內(nèi)，以蒸餾水為對(duì)照。于溫度(25±1)℃、相對(duì)濕度65%±10%、光周期14L:10D條件下培養(yǎng)，每個(gè)濃度重復(fù)3次。24 h后在顯微鏡下檢查死亡情況。用解剖針輕觸螨體，完全不動(dòng)者視為死亡。分別記錄不同處理的死亡螨數(shù)，計(jì)算死亡率。以Abbott公式計(jì)算校正死亡率，根據(jù)概率值分析法求出毒力回歸方程式、相關(guān)系數(shù)(r)及致死中濃度(LC50)［7-8］。

1.2.2 酶活性測(cè)定 1)酶液制備。選擇0．3%苦參堿水劑為供試藥劑，按照致死中濃度LC50配制濃度為7．18 mg/L的藥液備用。將采自校園內(nèi)的健康水杉葉片和葡萄葉片洗凈、晾干。用小型噴霧器噴施配制好的苦參堿藥液2 mL于水杉葉片，之后用零號(hào)毛筆將供試成螨接于葉片上;以蒸餾水處理為對(duì)照。根據(jù)劉氏短須螨危害葡萄的特性［1］，挑選先期取食水杉葉片的劉氏短須螨健康成螨，接于噴施2 mL蒸餾水的葡萄葉片上飼喂。各處理在24 h后挑取存活個(gè)體進(jìn)行酶活測(cè)定，每次取樣100頭，每個(gè)處理重復(fù)3次。根據(jù)各測(cè)定目標(biāo)酶的試劑盒說(shuō)明書，加入不同劑量的生理鹽水，制備成10%的組織勻漿，10 000 r/min于4℃下離心15 min，取上清液進(jìn)行測(cè)定。2)酶活性測(cè)定方法。過(guò)氧化物酶、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶和乙酰膽堿酯酶活性的測(cè)定方法均采用各個(gè)酶活性測(cè)定試劑盒提供的說(shuō)明書中的方法。每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析用SPSS 16統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，按劑量對(duì)數(shù)和死亡率機(jī)率值的直線回歸法，求得毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)R2、致死中濃度(LC50)及其95%置信限。過(guò)氧化物酶、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶和乙酰膽堿酯酶間的差異顯著性采用Duncan多重比較法檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 室內(nèi)毒力測(cè)定

2.1.1 室內(nèi)殺螨效果 見(jiàn)表1。

表1 4種藥劑不同濃度毒殺劉氏短須螨的效果

印楝素、阿維菌素、苦參堿和Bt各濃度梯度對(duì)劉氏短須螨均表現(xiàn)出殺螨效果，校正死亡率隨著處理濃度的升高而增加。印楝素的防治效果最佳，400倍液的校正死亡率為100%，1000倍液的校正死亡率為52．39%;其次為阿維菌素，400倍液的校正死亡率為97．61%，1000倍液的校正死亡率為40．46%;苦參堿和Bt的防治效果較差，400倍液的校正死亡率分別為52．39%和42．86%，1000倍液的校正死亡率分別僅為2．39%和4．76%。

2.1.2 毒力分析 印楝素對(duì)劉氏短須螨的毒力水平最高，致死中濃度LC50為5．36 mg/L;其次為苦參堿，LC50為7．18 mg/L;阿維菌素和Bt相對(duì)較低，LC50分別為20．18 mg/L和20．69 mg/L(表2)。

表2 4種藥劑對(duì)劉氏短須螨的毒力曲線及LC50

2.2 苦參堿對(duì)劉氏短須螨相關(guān)酶活性的影響

7．18 mg/L苦參堿處理24 h后，該螨體內(nèi)乙酰膽堿酯酶活力達(dá)到2．11 U/mgprot，較對(duì)照增加32倍，差異顯著(P＜0．05)。過(guò)氧化物酶活力為76．00 U/mgprot，較對(duì)照增加16倍，差異顯著(P＜0．05)。而谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶活力為0．02 U/mgprot，與對(duì)照相比差異不顯著(P＞0．05)。蒸餾水處理的劉氏短須螨轉(zhuǎn)移至葡萄葉上飼喂24 h后，3種解毒酶活性均有增強(qiáng)，但是差異未達(dá)顯著水平(P＞0．05)(表3)。

表3 苦參堿處理24 h對(duì)劉氏短須螨相關(guān)酶活性的影響

3 討論

已有研究顯示，阿維丙溴磷對(duì)劉氏短須螨的毒力最高，噠螨靈次之，甲維鹽防治效果最差［6］。本試驗(yàn)選用了4種生物農(nóng)藥對(duì)劉氏短須螨進(jìn)行室內(nèi)毒力測(cè)定，印楝素對(duì)劉氏短須螨的毒力最高，致死中濃度達(dá)到5．36 mg/L，苦參堿、阿維菌素和Bt致死中濃度分別為7．18 mg/L，20．18 mg/L和20．69 mg/L，說(shuō)明4種藥劑對(duì)劉氏短須螨都有一定的防治效果，印楝素致死中濃度最低且具有非常明顯的殺螨效果，可以作為首選的生物防治藥劑在生產(chǎn)中應(yīng)用;苦參堿致死中濃度也較低，且苦參堿為廣泛使用的植物源藥劑，效果較好。本研究?jī)H以幾種生物農(nóng)藥對(duì)劉氏短須螨進(jìn)行了室內(nèi)毒力測(cè)定，尚需對(duì)用藥時(shí)間、最佳用藥濃度以及適宜的施藥器械開(kāi)展進(jìn)一步的研究。

利用致死中濃度的苦參堿處理24 h后，劉氏短須螨的相關(guān)代謝酶活性發(fā)生了一定變化。其中過(guò)氧化物酶和乙酰膽堿酯酶活性顯著增加，而谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶活性變化不明顯。過(guò)氧化物酶廣泛存在于細(xì)胞內(nèi)，具有較高清除H2O2能力，己在大多數(shù)昆蟲中發(fā)現(xiàn)。乙酰膽堿酯酶是存在于神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的水解酶，該酶活性被抑制，將導(dǎo)致昆蟲的迅速死亡，其敏感性的變化，將直接影響蟲體中毒的程度。本研究中過(guò)氧化物酶活性升高說(shuō)明其在清除過(guò)多自由基上具有十分重要的作用，保持螨體內(nèi)細(xì)胞的穩(wěn)定，維持了螨正常的生長(zhǎng)發(fā)育。乙酰膽堿酯酶活性的增加體現(xiàn)了其在分解外源毒物，維持正常神經(jīng)生理代謝方面的作用。

谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶是1類催化還原型谷胱甘肽與各種親電化合物親核加成反應(yīng)的酶，在自然界普遍存在，在脊椎動(dòng)物、無(wú)脊椎動(dòng)物解毒代謝中發(fā)揮重要作用，是昆蟲體內(nèi)重要的解毒酶之一。參與包括對(duì)殺蟲劑在內(nèi)的許多異型生物質(zhì)的解毒［9］。因苦參堿對(duì)劉氏短須螨有毒殺作用，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶活性應(yīng)該被激活，引起劉氏短須螨對(duì)苦參堿的解毒，以維持正常的生理功能。但研究中發(fā)現(xiàn)處理組與對(duì)照組該酶的活力變化不顯著，可能與處理時(shí)間較短有關(guān)。

對(duì)保護(hù)酶、水解酶和解毒酶活力的測(cè)定有助于使用藥劑時(shí)選擇最低的適合濃度、最佳劑量以及所需處理的時(shí)間，既要達(dá)到干擾害蟲代謝，阻礙害蟲生長(zhǎng)發(fā)育或致死效應(yīng)，實(shí)現(xiàn)有效合理防治目的，又要避免產(chǎn)生抗藥性，或增加化學(xué)藥劑使用量造成環(huán)境污染，為尋找合理的生物防治新思路提供科學(xué)參考。

［1］ 馬恩沛，沈兆鵬，陳熙雯，等．中國(guó)農(nóng)業(yè)螨類［M］．上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1984:174-177．

［2］ Jeppson L R，Keifer H H，Baker E W．Mites injurious to econo-mic plants［M］．Berkeley:University of California Press，1975:614-617．

［3］ Elmer H S，Jeppson L R．Biology and control of the citrus flat mite［J］．Economical Entomology，1957，50(5):566-570．

［4］ 程小玲．湖北利川水杉原生種群保護(hù)的研究［J］．林業(yè)勘察設(shè)計(jì)，2004(2):19-21．

［5］ 劉毅，李宏軍．國(guó)家一級(jí)珍稀植物水杉母樹資源調(diào)查及其保護(hù)［J］．湖北林業(yè)科技，2006(6):46-48．

［6］ 樊斌琦，郝德君，葉建仁，等．四種農(nóng)藥對(duì)劉氏短須螨的毒力測(cè)定及藥效試驗(yàn)［J］．中國(guó)森林病蟲，2010，29(6):42-43．

［7］ 郭郛，忻介六．昆蟲學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)［M］．北京:科學(xué)出版社，1988:377-382．

［8］ 張宗炳．殺蟲藥劑的毒力測(cè)定［M］．北京:科學(xué)出版社，1988:363-368．

［9］ 呂敏，劉惠霞，吳文君．谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶與昆蟲抗藥性的關(guān)系［J］．昆蟲知識(shí)，2003，40(3):204-208．