郭開發(fā)，吳彩蘭，方曉翠，何麗，趙思峰

(新疆綠洲農(nóng)業(yè)病蟲害治理與植保資源利用自治區(qū)高校重點實驗室/石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆 石河子 832003)

胡楊Populus euphratica Oliv是塔里木河下游干旱荒漠區(qū)天然分布的唯一喬木樹種，對維護塔里木河下游地區(qū)的生態(tài)系統(tǒng)功能極為重要［1］。近50 a由于塔里木河流域上游水資源的大量開發(fā)，塔里木河下游斷流320 km，胡楊林因嚴(yán)重干旱脅迫而大面積衰敗［2］，許多胡楊樹發(fā)生腐爛病。莊文穎曾報道在中國西北地區(qū)胡楊腐爛病是由金黃殼囊孢Cytospora chrysosperma引起，該菌還可以導(dǎo)致灰胡楊、小葉楊、黑楊、歐美楊等幾十種楊屬植物的腐爛?。?］。另有研究依據(jù)形態(tài)學(xué)、ITS-rDNA gene和LSU gene測序結(jié)果認(rèn)為，在新疆的楊屬植物上還存在C．germanica，且該菌具有引起嚴(yán)重經(jīng)濟損失的潛在威脅［4］。為了明確塔里木河下游胡楊腐爛病的病原菌種類，以便進行準(zhǔn)確檢測與有效防控，本研究對2013年10月采自新疆巴音郭楞蒙古自治州鐵門關(guān)市周邊的胡楊腐爛病菌進行了鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料2013年10月從新疆巴音郭楞蒙古自治州鐵門關(guān)市周邊采集胡楊樹腐爛病樣品12份，且病樣有典型的黃褐色卷須狀分生孢子角(圖1-A)。

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA):去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，水1000 mL，pH 6．8;

馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PD):去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，水1000 mL，pH 6．8;

水瓊脂培養(yǎng)基(WA):瓊脂20 g，水1000 mL。

1.2 病原分離與致病性測定

1.2.1 病原分離與純化 采用常規(guī)組織分離法［5］在PDA平板上分離病原菌。待分離物長出后，在WA平板上單孢純化，將純化后獲得的菌株保存在PDA斜面上，置4℃冰箱中儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 致病性測定 采用離體枝條接種法［6］進行致病性測定。選取2年生健康的胡楊和新疆楊枝條，截取20 cm長的小段，自來水沖洗后用0．1%HgCl2浸泡10 min，然后用無菌水沖洗、晾干，枝條頂端用石蠟封口。用燒熱的鐵釘釘帽(直徑7 mm)間隔一定距離燙傷樹皮，把病原菌餅(直徑7 mm)接種在燙傷處，在接種部位上方1～2 cm處加1塊濕的脫脂棉，用保鮮膜將其和接種體同時包扎。每個分離株、每種寄主接5段枝條。每段枝條上3個接種點，隨機選取1個傷口以接無菌PDA圓餅為空白對照。于10 d后觀察、記錄枝條發(fā)病情況，并對發(fā)病枝條進行菌物再分離。

1.3 病原物的鑒定

1.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定 供試菌株接種在離體胡楊枝條上，待其產(chǎn)生產(chǎn)孢體后，挑取產(chǎn)孢體，用雙面刀片直接切片，制成玻片后在生物顯微鏡下觀察縱、橫切面形態(tài)特征并測量分生孢子大小，記錄并拍照。

1.3.2 分子鑒定 依據(jù)形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，挑選TMG3，TMG5和TMG9這3株代表菌株在PDA平板上培養(yǎng)3 d后用打孔器打取直徑為7 mm菌塊接種至裝有300 mL PD培養(yǎng)基的500mL的三角瓶中，28℃，200 r/min搖床培養(yǎng)3 d。用雙層紗布過濾菌絲，滅菌水沖洗菌絲體至澄清，晾干，采用Lee等人的方法提取菌絲基因組DNA［7］。借鑒Peever等人［8］的方法，用通用引物ITS1和ITS4擴增代表菌株的ITS和5．8SrDNA，用引物Beta-F和Beta-R擴增代表菌株的β-tubulin基因。PCR反應(yīng)體系:PCR TaqMix 10μL，10μmol/L ITS1/Beta-F 1μL，10μmol/L ITS4 /Beta-R 1μL，基 因 組DNA 0．5μL，ddH2O 12．5μL至終體積為25μL。ITS基因PCR擴增反應(yīng)程序為94℃預(yù)變性4 min，然后94℃變性40 s，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，共30個循環(huán)，最后72℃延伸10 min;β-tubulin基因PCR擴增反應(yīng)程序為:94℃預(yù)變性3 min，然后94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。反應(yīng)完成后，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR反應(yīng)產(chǎn)物。將不同引物的PCR反應(yīng)產(chǎn)物進一步純化后委托北京六合華大基因科技股份有限公司進行測序。測序后的序列經(jīng)校正后，在核酸序列數(shù)據(jù)庫GenBank中進行同源序列搜索(Blast搜索)，比較測試菌株同現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫中相應(yīng)序列的相似程度，用DNAMAN軟件進行比對并構(gòu)建系統(tǒng)樹，應(yīng)用自展法(Bootstrap)檢驗系統(tǒng)樹，自展數(shù)據(jù)集為1000次。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的致病性測定人工接種2年生健康的胡楊和新疆楊枝條后，12個分離菌株均導(dǎo)致胡楊和新疆楊枝條發(fā)病。接種7 d后接種部位出現(xiàn)褐色、水浸狀病斑。隨后病斑縱向橫向擴展至繞枝條一周。枝條病斑部位表皮皺縮，病健交界明顯(圖1-B，C)。接種10 d后，病斑表面產(chǎn)生大量黑色小點，室溫較為干燥的條件下，產(chǎn)孢體孔口會溢出橘黃色的分生孢子角。對發(fā)病組織進行再分離，均可獲得相應(yīng)的接種菌株。對照枝條上未出現(xiàn)腐爛病癥狀。

圖1 胡楊樹腐爛病癥狀及致病性測定結(jié)果

2.2 病原物形態(tài)鑒定室內(nèi)培養(yǎng)，菌落較緊密，菌落白色至乳白色，菌落背面米黃色。培養(yǎng)后期褐色產(chǎn)孢體隨機在菌落分布(圖2)。子座埋生在樹皮中，突出，褐色，圓形至橢圓形，直徑1．5～1．9 mm;孔口1個，黑色，與頂盤同高;分生孢子器由大量內(nèi)陷的小腔室組成，共用壁，不規(guī)則排列呈玫瑰花座狀;分生孢子透明、香蕉形，大小為(3．5～5．0)μm×(0．9～1．4)μm;分生孢子角橘黃色至橘紅色(圖3)。依據(jù)形態(tài)特征將病原菌鑒定為金黃殼囊孢Cytospora chrysosperma。

圖2 C.chrysosperma在PDA培養(yǎng)基上菌落特征(A，正面;B，背面)

圖3 Cytospora.chrysosperma形態(tài)特征

2.3 病原物分子鑒定分離菌株的DNA提取后經(jīng)電泳檢測，所得DNA片段約為2000 bp。利用ITS和β-tubulin兩個基因?qū)υ摬≡M行PCR擴增，經(jīng)電泳檢測分別獲得一條大小約為550 bp、500 bp的清晰條帶(圖4)，將所測得的序列登陸NCBI(http://www．ncbi．nlm．nih．gov/blast)進行Blast比對。通過DNAMEN建立系統(tǒng)發(fā)育樹(圖5，6)。ITS和β微管蛋白序列分析:通過DNAMAN進行系統(tǒng)發(fā)育分析，通過最大簡約法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。3個代表菌株的rDNA ITS序列(登錄號分別為KP114124．1，KP114125．1和KP114126．1)與已登錄的菌株C．chrysosperma(KJ739472)具有很高的Bootstrap支持率，相似率達(dá)到99%(圖5)。3個代表菌株的β微管蛋白基因(登錄號分別為KP117037．1，KP117038．1，KP117039．1)與已登錄的菌株C．chrysosperma(JQ900372)達(dá)到98%以上的相似率(圖6)。

圖4 胡楊腐爛病菌代表菌株P(guān)CR擴增結(jié)果(A，ITS;B，β-tubulin)

圖5 代表菌株基于ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖6 代表菌株基于β-tubulin序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論與結(jié)論

殼囊孢屬Cytospora種類較多，分布范圍廣，種間的形態(tài)特征具有較大的相似性。按照傳統(tǒng)的病原菌分類鑒定十分困難。ITS和β-tubulin序列分析用于殼囊孢屬的分類和系統(tǒng)發(fā)育研究已被證明是可行的［9］。金黃殼囊孢危害楊樹、柳樹、桉樹等多種林木樹種，在西北、華北及東北地區(qū)是危害楊樹生產(chǎn)的主要病原因子［10］。楊明秀 等認(rèn)為金黃殼囊孢在我國培養(yǎng)性狀上存在明顯的遺傳多樣性，遺傳多樣性與地理來源有一定關(guān)系，但致病性多樣性與地理來源無明顯關(guān)系［11］。孫祥瑞對河北省白楊樹腐爛病病原鑒定也為金黃殼囊孢［12］。目前已報道的能引起楊屬主要林木腐爛病的病菌有金黃殼囊孢［3，12］和C．germanica。本研究表明新疆塔里木河下游胡楊樹腐爛病的病原物為金黃殼囊孢，該菌與新疆已報道的楊樹等樹木上的腐爛病菌為一個種。致病性測定結(jié)果也表明，該菌既可侵染胡楊，也可侵染新疆楊，但該病原菌在兩種林木上能否傳播以及不同寄主來源的病菌是否存在致病性差異還有待于進一步研究。

［1］ Pei Zhiqin，Xiao Chunwang，Dong Dan，et al．Comparison of the fine root dynamics of Populus euphratica forests in different habitats in the lower reaches of the Tarim River in Xinjiang，China，during the growing season［J］．Journal of Forest Research，2012，17(4):343-351．

［2］ 陳亞鵬，陳亞寧，徐長春，等．塔里木河下游地下水埋深對胡楊氣體交換和葉綠素?zé)晒獾挠绊懀跩］．生態(tài)學(xué)報，2011，31(2):0344-0353．

［3］ Zhuang Wenying．Fungi of northwestern China［M］．Ithaca:Mycotaxon Ltd，2005:1-430．

［4］ Zhang Q T，He M，Lu Q，et al．Morphological and molecular identification of Cytospora germanica causing canker on Populus spp．in China［J］．Plant disease，2013，97(6):846．

［5］ 方中達(dá)．植病研究方法［M］．3版．北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，1998:122-124．

［6］ 臧睿，黃麗麗，康振生，等．陜西蘋果樹腐爛病菌(Cytospora spp．)不同分離株的生物學(xué)特性與致病性研究［J］．植物病理學(xué)報，2007，37(4):342-251．

［7］ Lee SB，Milgroom M G，Taylor J W．A rapid，high yield miniprep method for isolation of total genomic DNA from fungi［J］．Fungal Genetics Newsletter，1988，35:23-24．

［8］ Peever TL，Su G，Carpenter-Boggs L，et al．Molecular systema-tics of citrus-associated Alternaria species［J］．Mycologia，2004，96(1):119-134．

［9］ 杜琴，孔利，趙思峰，等．新疆庫爾勒香梨腐爛病病原鑒定［J］．新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，50(12):2258-2265．

［10］ 張星耀，陳海燕，梁軍，等．金黃殼囊孢菌(Cytospora chrysosperma)的培養(yǎng)性狀和營養(yǎng)體親和性［J］．西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2007，35(3):99-105．

［11］楊明秀，宋瑞清．中國金黃殼囊孢菌的致病性分化及遺傳多樣性［J］．林業(yè)科學(xué)，2013，49(6):115-121．

［12］孫祥瑞．幾種樹皮腐爛病菌鑒定和生物學(xué)特性的研究［D］．河北 保定:河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010．