張彥琴

(山西省農業(yè)科學院旱地農業(yè)研究中心，山西太原030031)

玉米作為世界上三大糧食作物之一，又是重要的糧食、飼料作物，同時也是現(xiàn)代工業(yè)的重要原料，其在農業(yè)生產中占有非常重要的地位。隨著世界人口的不斷增長和畜牧業(yè)、工業(yè)的發(fā)展，玉米的總需求量將不斷攀升，其生產面臨巨大挑戰(zhàn)。一直以來，玉米育種學家已經(jīng)采用常規(guī)育種方法，培育出了很多優(yōu)良雜交種，并且對農業(yè)生產作出重大貢獻。但玉米的常規(guī)遺傳改良育種方法存在優(yōu)良親本自交系當選率低、育種周期長、遺傳連鎖難以打破、優(yōu)良組合預見性差等缺點。而轉基因技術在植物育種中的應用，取得了常規(guī)育種方法難以達到的效果和效益，隨著轉基因技術的快速發(fā)展，它已經(jīng)成為作物育種的重要輔助手段，成為農業(yè)生物技術的核心領域。近年來，玉米作為轉基因技術的主要研究對象，已經(jīng)受到各國科學家的廣泛關注。1990年Gordon-Kamm等［1］首次獲得可育的轉基因玉米后，相繼又有許多實驗室成功應用基因槍、電擊、農桿菌介導等技術將外源基因導入到玉米細胞中，獲得了可育的轉基因玉米植株。

1 玉米轉基因技術研究現(xiàn)狀

玉米的基因導入方法主要包括兩大類:根癌農桿菌介導轉化和DNA直接導入轉化。DNA直接導入轉化方法包括基因槍法、電擊法、花粉管通道法、聚乙二醇導入法、陽離子轉化法、子房注射法等。其中，基因槍法是玉米遺傳轉化中應用最多且效果最好的方法。

1．1 農桿菌介導轉化法 農桿菌介導轉入法是目前轉基因技術最常用的一種方法。根癌農桿菌屬根瘤菌科，是一種能夠侵染雙子葉植物及部分單子葉植物根或莖部傷口使之形成冠癭瘤的革蘭氏陰性桿菌［2］。根癌農桿菌通過其含有的Ti質粒DNA直接轉到植物基因組上而使植物得到轉化，因此，農桿菌是一種天然的植物基因轉化系統(tǒng)。農桿菌在雙子葉植株中的轉化已經(jīng)非常成功，但由于玉米等單子葉植物不是農桿菌的天然寄主，單子葉植株轉化研究落后于雙子葉植株。1987年Bytebier等［3］利用農桿菌Ti質粒轉化成功首株單子葉植物石刁柏。1990年Gould等［4］用農桿菌成功轉化玉米莖尖組織，并且能夠遺傳到R1代。

1．2 基因槍法 基因槍法又叫微彈轟擊法，其原理是攜帶了外源基因的金屬微彈在高壓所產生的推力下高速穿透植物組織或受體細胞，從而使外源基因導入到受體細胞核并整合到植物基因組中實現(xiàn)遺傳轉化的過程［5］。該技術也是植物轉基因技術中常使用的方法之一?；驑尫ㄊ荏w類型廣泛，凡是能被基因槍微彈穿透的組織都可以作為其轉化的受體，但是具有潛在分化能力的受體細胞更容易接受外源DNA，且轉化率更高。該方法的優(yōu)點不受基因型的限制，缺點是由外源基因整合的拷貝數(shù)多、穩(wěn)定性差。

1987年美國康奈爾大學Sanford等［6］最先建立了基因導入的方法。1989年Klein等［7］第一次將基因槍法應用到玉米轉化中并獲得了成功。1994年趙天永等［8］利用基因槍法將GUS基因導入到玉米莖尖組織。Wan等［9］利用基因槍法將pat和GUS基因轉入玉米I型愈傷組織。

1．3 花粉管通道法 花粉管通道法原理是植物授粉后，將外源DNA沿花粉管滲入、經(jīng)珠心通道進入胚囊，從而轉化尚不具備正常細胞壁的卵、合子或早期胚胎細胞［10］?；ǚ酃芡ǖ婪ㄊ轻槍τ衩椎拈_花習性、花器結構和受精過程采用的一種全新的外源基因導入方法。該方法不受植株基因型限制，可以將任何品種的外源基因導入，直接運用到常規(guī)育種中;操作簡便，無需建立愈傷組織誘導，易于實現(xiàn)規(guī)?；D化;經(jīng)濟適用，省時省力，成本低。

花粉管通道法最初是由周光宇等［11］提出并發(fā)展起來的，他首先在棉花的基因轉化上獲得成功。祁永紅等［12］利用花粉管技術將外源總DNA成功導入到玉米自交系，獲得了廣泛變異不同類型的自交系。

1．4 其他方法 除上述3種導入方法外，還有聚乙二醇導入法、電擊法、超聲波介導法、陽離子轉化法、子房注射法等，都是轉基因玉米研究中使用過的導入方法，且都有成功的報道。

2 轉基因技術在玉米中的應用

2．1 抗除草劑轉基因玉米 除草劑是現(xiàn)代農業(yè)育種中不可缺少的一部分，其對節(jié)省勞動力、提高勞動效率、保護土壤結構等方面起到了較好的作用，但除草劑也會不同程度地對農作物造成一定的傷害，且玉米對除草劑極為敏感。因此，篩選出對各種除草劑有超強抗性的基因整合到玉米中，培育出新型的抗除草劑轉基因玉米是控制雜草的高效、低成本、無公害新手段。

目前，就世界范圍看，抗除草劑轉基因玉米已經(jīng)進入了商業(yè)性生產，國外一些轉基因育種公司都推出了抗除草劑轉基因玉米品種，包括美國孟山都公司的抗草甘膦玉米、艾格羅公司的抗草銨膦玉米、氫氨公司的抗咪唑啉酮玉米等。

2．2 抗蟲轉基因玉米 蟲害是導致玉米減產的一個重要因素，目前，化學殺蟲劑是控制玉米蟲害的主要方法，但化學殺蟲劑不僅殺死害蟲，也殺死了害蟲的天敵，長此以往，環(huán)境污染日益嚴重，生態(tài)平衡遭到破壞。其次，化學殺蟲劑還會導致玉米中有農藥殘留、害蟲產生抗藥性等負面問題?？瓜x轉基因玉米是解決殺蟲劑負面影響的有效方法。目前，Bar基因在抗除草劑基因中應用最廣泛。

Schnepf等［13］首次從蘇云金芽孢桿菌成功地克隆了一個編碼殺蟲晶體蛋白的毒蛋白Bt基因。1996年，Bt基因玉米正式進入商品化生產，截止目前，已商業(yè)化種植了很多抗蟲轉基因玉米。2003年，美國孟山都公司引入了防治鱗翅目害蟲的抗蟲基因cry1Fa2和抗根葉甲蟲防治基因cry3Bb1。中國農業(yè)大學劉桂玲等［14］將Bt基因轉入玉米獲得抗蟲轉化體，且在后代分離出了能正常遺傳的家系。王國英等［15］利用基因工程法成功把Bt基因導入到玉米幼胚中，Cry1A(b)基因在再生植株中得到表達，育成了穩(wěn)定的抗蟲轉基因玉米。王景雪等［16］利用花粉管通道法分別將Bt毒蛋白基因和幾丁質酶基因導入玉米。

2．3 抗病轉基因玉米 影響玉米生長的病害主要可分為三大類:病毒性病害(玉米粗縮病、矮花葉病等)、真菌性病害(玉米紋枯病)和細菌性病害［17］。這些病害也是導致玉米品質和產量下降的重要因素之一。研究發(fā)現(xiàn)，玉米抗矮花葉病毒能力與矮花葉病毒外殼蛋白基因互補的hpRNA發(fā)夾結構的長度有關［18］;大腸桿菌的核糖核酸內切酶基因能有效增強玉米對粗縮病的抗性［19］;沉默胱抑素基因(CC9)對玉米黑粉病有一定的抗性［20］;兔防御素基因(NP－1)轉入玉米可有效防治玉米大斑病［21］。

2．4 抗旱、耐鹽轉基因玉米 我國水資源緊缺，多數(shù)為干旱和半干旱土地，甚至有大片鹽漬土壤，因此，提高玉米抗逆性，培育抗旱、耐鹽轉基因玉米是保證玉米穩(wěn)產的一個重要手段。何鍶潔等［22］將甜菜堿醛脫氫酶基因導入玉米中，獲得耐鹽植株;劉巖等［23］將大腸桿菌6-磷酸山梨醇脫氫酶基因導入玉米，轉化體可在2%鹽濃度中生長;任曉燕等［24］將山菠菜膽堿單加氧酶(AhCMO)導入玉米自交系，玉米耐鹽性明顯提高;Amara等［25］在玉米中大量表達的LEA Rab28蛋白，Wang等［26］轉入玉米的編碼磷脂酰肌醇磷脂酶ZmPLC1基因，玉米的抗旱性增強。

2．5 改良玉米品質 轉基因玉米還可改良玉米品質，Bicar等［27］利用基因槍法在玉米自交系中導入a-lactalbumin基因，提高了玉米胚乳中醇溶蛋白的含量;關淑艷等［28］利用花粉通道法導入sbe2a基因，提高了玉米胚乳中直鏈淀粉的含量;丁明忠等［29］將大豆總DNA導入玉米，提高了玉米種子中的蛋白質含量;張秀君等［30］將馬鈴薯花粉特異水溶性蛋白的cDNA導入玉米，提高了玉米種子干重中的賴氨酸含量。

利用基因工程技術對玉米進行分子育種，除在抗除草劑、抗蟲、抗病、抗旱、改良玉米品質等方面進行探索，獲得預期效果外，還在獲得高蛋白基因、雄性不育基因、抗寒基因等方面作了研究。

3 玉米轉基因技術研究發(fā)展趨勢

3．1 發(fā)展多基因轉化和基因聚合的技術 發(fā)展玉米多基因轉化和基因聚合技術，使其具有復合性狀是未來玉米轉基因技術研究的明顯特點。孫越等［31］將 cry1AcM、epsps、GAT、ZmPIS基因同時導入玉米，獲得了兼抗蟲、抗除草劑、抗干旱優(yōu)良復合性狀的轉基因玉米新材料。

3．2 發(fā)展基因打靶或基因定點重組技術 由于轉基因技術插入位點和插入拷貝數(shù)的不確定性，基因表達效果不可預知?；虼虬屑夹g可使外源基因定點整合到核基因組上，避免基因隨機插入導致的表達不確定性和對原基因組的損害，該技術避免了傳統(tǒng)育種步驟的繁瑣，可快速精確培育出新品種。但該技術打靶效率低，目前，可利用嵌合寡核苷酸介導單堿基置換、利用高效正負篩選同源重組子或利用ZFNs在染色體DNA上引入定點斷裂，促進同源重組介導的基因定點整合和置換。

3．3 發(fā)展安全的轉化系統(tǒng) 轉基因玉米的安全問題涉及目的基因及整合基因，整合基因的安全性主要是篩選標記的安全性。近年來，人們越來越重視這些篩選標記基因對生態(tài)系統(tǒng)和人類的影響。因此，培育無選擇標記的轉基因玉米將是未來發(fā)展的方向。

4 小結

轉基因育種是一項復雜的工程，還需要不斷完善轉基因技術，從擴大群體、淘汰選擇最終向著精確插入、穩(wěn)定表達的方向研究。相信，隨著更多高價值基因的發(fā)現(xiàn)、育種轉化技術的發(fā)展以及政府政策和監(jiān)督管理制度的完善，轉基因玉米將會更好地服務于農業(yè)生產。

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