呂瑞 綜述 李增軍 審校

中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院血液學研究所血液病醫(yī)院淋巴瘤中心，天津300020

慢性淋巴細胞白血病的克隆演變

呂瑞 綜述 李增軍#審校

中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院血液學研究所血液病醫(yī)院淋巴瘤中心，天津300020

慢性淋巴細胞白血?。╟hronic lymphocytic leukem ia，CLL）的克隆演變、遺傳異質(zhì)性均影響疾病的發(fā)展及治療決策的選擇，其中線性模式及分支模式是目前公認的CLL的主要克隆演變模式?；谛滦头肿由飳W技術的發(fā)展，相關研究正在逐步揭開克隆演變及遺傳異質(zhì)性的神秘面紗，為預測疾病復發(fā)、治療反應及耐藥指引了方向。

慢性淋巴細胞白血??；克隆演變；遺傳異質(zhì)性

CLL是一種成熟B淋巴細胞的惡性克隆性疾病，其臨床表現(xiàn)具有異質(zhì)性：大部分患者的疾病呈惰性進程，逐漸出現(xiàn)治療指征，并于治療后可在相當長的時間內(nèi)維持穩(wěn)定；少部分發(fā)病后迅速進展并出現(xiàn)耐藥，甚至短期內(nèi)發(fā)生轉化，成為侵襲性淋巴瘤。重現(xiàn)性遺傳學異常對CLL預后及治療反應的提示作用已得到重視并被用于臨床[1-4]，隨著研究的深入及深度測序技術的開展，不少學者發(fā)現(xiàn)，在CLL發(fā)展及治療過程中，其部分優(yōu)勢遺傳學特征發(fā)生了一系列的變化，即存在克隆演變現(xiàn)象。本文旨在針對克隆演變及其模式進行總結，以期探討其臨床意義。

1 CLL的遺傳異質(zhì)性及克隆演變

CLL細胞因其遺傳學異質(zhì)性的不同而表現(xiàn)出各異的生物學行為。例如：IgHV突變狀態(tài)可影響CLL的臨床表現(xiàn)及預后[5]；單獨的13q染色體缺失通常被認為是預后良好的標志；11q缺失往往以多發(fā)淋巴結增大為突出表現(xiàn)，具有侵襲性，但多數(shù)情況下對氟達拉濱有治療反應；17p缺失及TP53突變往往表現(xiàn)出高度的侵襲性，且對絕大多數(shù)細胞毒性藥物耐藥[1-2]。隨著染色體核型、間期熒光原位雜交（interphase fluorescence in situ hybridization，iFISH）技術在臨床上的應用，以及比較基因組雜交、單核苷酸多態(tài)性分析、深度測序技術的發(fā)展，學者們對CLL細胞遺傳學特征的認識進一步加深，對其發(fā)生、發(fā)展過程中的克隆演變更加重視。

克隆演變的基本理論[6]為：腫瘤細胞存在廣泛的克隆演變現(xiàn)象，其內(nèi)部克隆異質(zhì)性和在多種選擇壓力下的克隆進化是腫瘤復發(fā)進展并導致最終治療失敗的重要原因。在CLL中，不同遺傳學異常在疾病發(fā)生的不同階段的分布不均衡[1，7]：在新診斷的CLL患者中，單獨的13q缺失占35%～40%，12號染色體三體占15%，11q缺失占15%～20%，而17p缺失/TP53突變僅占5%～10%；但在復發(fā)/難治的CLL中，17p缺失/TP53突變的比例卻明顯增高。這提示，在CLL細胞中，某些遺傳學特征是在疾病發(fā)生較早期即表達的，而某些遺傳學因素則是在疾病發(fā)展過程中獲得的。

在對CLL克隆演變的研究中，Janssens等[8]應用iFISH技術動態(tài)監(jiān)測了95例CLL患者，發(fā)現(xiàn)11例患者在病程中有新發(fā)的11q22/17p13缺失；與此同時，部分攜帶異常遺傳學克隆的患者經(jīng)治療后，其原有的異常克隆被完全抑制，以致無法被檢出。Zhang等[9]應用單核苷酸多態(tài)性技術，較好地闡釋了CLL的克隆多態(tài)性并為進一步研究創(chuàng)造了條件。Braggio等[10]采用比較基因組雜交方法，按照治療前后的不同時間點檢測了22例CLL患者的遺傳學特征，證實該法可有效發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢克隆的變化，從而驗證克隆演變現(xiàn)象的存在。盡管上述結果不能完全反映CLL基因組全貌，且上述技術的應用仍受到一定程度的限制，但仍有力地證實CLL中廣泛存在遺傳學異質(zhì)性及克隆演變，為進一步的研究奠定了基礎。

隨著深度測序技術的出現(xiàn)，人們對CLL的遺傳學特征有了進一步的認識。除TP53外，BIRC3、SF3B1及NOTCH1基因的突變不但被先后鑒別出，而且還證實了它們與CLL的疾病進展、IgHV未突變狀態(tài)及不良預后的相關性[2-4，11-14]。Baliakas等[4]入組3400余例CLL患者，研究上述的遺傳學特點，發(fā)現(xiàn)BIRC3突變在CLL早期患者中的發(fā)生率較低（＜3%），NOTCH1突變在12號三體患者的克隆中常見，SF3B1突變在11q缺失的患者中高發(fā)，而BIRC3突變在17p缺失的患者中幾乎不存在，卻常見于12號三體及11q缺失的患者中，從而為克隆突變的不同方式提供佐證；此外，他們同時發(fā)現(xiàn)，隨著病情的發(fā)展，SF3B1及TP53的突變率增高，但NOTCH1基因的突變率卻不隨之改變，據(jù)此推測不同基因突變在CLL的克隆演變過程中可能發(fā)揮不同的作用。

2 CLL的克隆演變模式

CLL是一類惰性的B淋巴細胞增殖性疾病，患者的中位生存時間長，腫瘤基因相對穩(wěn)定；故與增殖性強的惡性腫瘤相比，其克隆演變的研究更困難。隨著分子生物學技術，尤其是深度測序技術等新一代測序技術的開展，越來越多的學者將關注焦點集中在CLL的總體演變模式及驅動因子上。

Baliakas等[4]根據(jù)SF3B1、TP53及NOTCH1突變率隨疾病發(fā)展變化的關系推測，NOTCH1基因突變可能作為最初驅動因子在腫瘤發(fā)生過程發(fā)揮作用，而SF3B1及TP53突變更可能在疾病進展過程中積累并作為克隆發(fā)展的后續(xù)驅動因子而存在。Ouillette等[15]入組156例CLL（其中42例接受治療干預）患者，應用單核苷酸多態(tài)性（SNP）檢測雜合性缺失及獲得性拷貝數(shù)變異的情況，并用Sanger測序檢測突變。他們發(fā)現(xiàn)：TP53突變既可在發(fā)病階段就存在，也可在疾病發(fā)展過程中“獲得”，但無論何時出現(xiàn)，均可作為驅動因素，導致復雜的克隆性異常；在接受及未接受治療的患者中，化療本身對克隆演變確實起到促進作用，但化療所致的遺傳學異常卻與未化療患者相同，從而提示優(yōu)勢克隆往往事先存在，而在外界干預因素作用下才被進一步顯現(xiàn)；最后，縱向研究結果提示逾99%的患者的遺傳學特征與起病時相同，這導致他們進一步提出了CLL克隆演變的線性進展型模式：即，初診時的克隆可獲得一種或多種遺傳學異常，但隨著病情發(fā)展及治療干預，僅有一種優(yōu)勢克隆被顯現(xiàn)出來，而原優(yōu)勢克隆的殘存或原優(yōu)勢克隆在內(nèi)外因素的促進下獲得新的遺傳學異常是導致疾病復發(fā)進展的根源。

在以上研究中，大部分學者均強調(diào)單一優(yōu)勢克隆在疾病發(fā)展中的主導作用，并未提到其他亞克隆與優(yōu)勢克隆之間的關系，但不少學者在這一領域卻有不同的發(fā)現(xiàn)。Schuh等[16]利用全基因組測序技術，在3例CLL患者中追蹤亞克隆，發(fā)現(xiàn)其中1例患者在疾病發(fā)展過程維持原克隆不變，但另2例卻逐漸顯現(xiàn)出與優(yōu)勢克隆伴行的新發(fā)亞克隆，從而提示不同CLL患者可能存在不同的克隆演變方式，優(yōu)勢克隆可能與亞克隆之間存在著此消彼長、相互作用的關系。Landau等[17]應用外顯子測序法在149例CLL患者中檢測新突變時發(fā)現(xiàn)：部分異常（如12染色體三體及13q缺失）往往存在于絕大多數(shù)的CLL患者中，且在疾病發(fā)生的早期即已存在；而TP53、SF3B1及ATM僅在部分克隆中存在，更傾向于表現(xiàn)為亞克隆的特征；伴隨治療出現(xiàn)的新的亞克隆與患者的不良預后相關，這證實了在治療后進展患者中研究這部分新發(fā)分子標志的重要性。此外，Rossi等[18]用深度測序法發(fā)現(xiàn)：原少量存在的伴TP53突變的亞克隆經(jīng)治療等因素陽性選擇后可逐漸取代原先的優(yōu)勢克隆，從而成為導致疾病復發(fā)的新的優(yōu)勢克??；這提示，在CLL的克隆演變過程中，同時存在著非線性的發(fā)展方式。

Ojha等[19]用深度測序法在12例患者中發(fā)現(xiàn)，33%（4/12）的患者的優(yōu)勢克隆持續(xù)存在，而67%（8/ 12）的患者的優(yōu)勢克隆在病程中發(fā)生變化。以上研究證實CLL的疾病進展過程中廣泛存在兩種主要的克隆演變模式，即線性進展模式及分支模式。在線性模式中，優(yōu)勢克隆始終維持不變，只是獲得性的遺傳學異常使優(yōu)勢克隆的生物學特征發(fā)生了改變；而在分支模式中，病程中出現(xiàn)多種亞克隆，它們相互競爭，此消彼長，優(yōu)勢克隆及亞克隆均可同時受自身及各種外界環(huán)境因素的影響而產(chǎn)生新的遺傳學變異。此外，Ojha等還在2例擁有不同亞克隆的患者中首次發(fā)現(xiàn)，其不同亞克隆可在同等外界環(huán)境因素作用下產(chǎn)生類似的“反應”，即引起優(yōu)勢及非優(yōu)勢克隆中相同基因的“被趨動”，從而表現(xiàn)出同一干預因素誘導的進化“趨同性”。

因此，CLL的克隆演變源于治療干預和隨機突變的積累。盡管目前研究對其相關模式及驅動因素的揭示僅為冰山一角，還有太多的未知內(nèi)容，但對其日益深入的了解將為臨床提供重要的信息。

3 CLL克隆演變的臨床意義

CLL的克隆演變是內(nèi)因及外因共同作用的結果，對其遺傳異質(zhì)性及克隆演變進行研究有助于學者們加深對疾病進展及耐藥的理解，同時在預測疾病轉歸及指導治療方面也有重要意義。

首先，克隆異質(zhì)性與克隆演變的互相促進是導致疾病進展及耐藥發(fā)生的重要原因。同一腫瘤中可并存多種起源的克隆，可能以一種克隆為主，即優(yōu)勢克隆，這種腫瘤中多種細胞克隆并存的現(xiàn)象被稱為克隆異質(zhì)性[20]。腫瘤的克隆演變繼發(fā)的耐藥往往是治療失敗的關鍵。基于克隆演變模型，除起病時就具有耐藥性優(yōu)勢克隆的原發(fā)耐藥外，大多數(shù)腫瘤起病時的優(yōu)勢克隆均對藥物敏感，而其繼發(fā)耐藥的機制分為三個方面[6，21]：一方面，優(yōu)勢敏感克隆一度對治療有效，但由于自身基因的不穩(wěn)定性及外界因素（如治療等）的干預，出現(xiàn)克隆進化和克隆異質(zhì)性，因獲得了新的、耐藥相關的遺傳學特征而對藥物不敏感；另一方面，通過內(nèi)外因素的選擇作用，原先具有耐藥特征的亞克隆進一步發(fā)展為優(yōu)勢克??；最后，原先非優(yōu)勢地位的敏感亞克隆在演變過程也可獲得了新的耐藥特征，并進一步發(fā)展成優(yōu)勢克隆，導致疾病的復發(fā)進展。目前，CLL繼發(fā)耐藥模式的研究仍以前兩種方式為主[16-19]；但不斷深入的研究將為CLL的耐藥方式提供更多信息。

CLL的克隆演變導致了一系列新遺傳學異常的出現(xiàn)，基于新一代分子生物學技術，新遺傳學指標的發(fā)現(xiàn)不但提高了對CLL預后的判斷價值，而且還為所用藥物的選擇提供了指導。新的預后分期體系[2-4]將17p缺失/TP53突變及BIRC3突變的患者歸入高危組，其5年和10年總生存率分別為50.9%和29.9%；將NOTCH1、SF3B1突變及11q缺失/ATM突變的患者歸入中危組，其5年和10年總生存率分別為65.9%和37.1%；將12三體及正常核型歸入低危組，其5年和10年總生存率分別為77.6%和57.3%；而最后將單獨13q缺失的患者納入極低危組，其相應的5年和10年總生存率分別為86.9%和69.3%，從而使不同遺傳學及預后特征的CLL患者得到更好地區(qū)分。有學者研究不同遺傳學特征對不同新藥的反應時發(fā)現(xiàn)：TP53及SF3B1突變或BIRC3異常與氟達拉濱耐藥相關[22]，NOTCH1突變的患者不能從抗CD20單克隆抗體中獲益[3]，抗CD52單克隆抗體聯(lián)合氟達拉濱/環(huán)磷酰胺方案可部分克服TP53突變對CLL的不良影響[23]，BCR途徑中BTK抑制劑Ibrutinib和PI3K抑制劑Idelalisib也可克服或部分克服TP53突變引起的不良影響[24]。因此，在CLL治療伴隨的克隆演變過程中，只有充分把握上述遺傳學特征，才能在疾病進展的不同階段準確判斷預后并采取行之有效的治療措施。

克隆異質(zhì)性無疑是實施個體化治療的巨大障礙。隨著靶向藥物及單克隆抗體的出現(xiàn)，CLL的治療模式也發(fā)生著轉變。2013年，美國血液年會提出了個體化治療（tailored）、靶向治療（targeted）和微小殘留?。∕RD）清除（total eradiation of MRD）的“3T模式”[24]，旨在通過個體化治療盡可能減少藥物毒性作用，在此基礎上盡量消除腫瘤，達到“接近治愈”的目的。對亞克隆存在的認識有助于避免進入從始至終單一用藥的誤區(qū)；而對疾病進展過程中克隆進化具體情況（其保持穩(wěn)定還是以線性或者分支模式進展）的了解，則是進行危險因素分層并制定個體化治療策略的關鍵所在，也是根除所有亞克隆的基礎。只有兼顧優(yōu)勢克隆及亞克隆，才有希望在有效治愈的基礎上兼顧復發(fā)風險的降低，從而全面提高CLL患者的遠期治療效果，延長其總生存時間。

4 總結與展望

CLL的克隆演變在一定程度上是達爾文自然選擇模式的反應。腫瘤克隆在其自身及外界因素的影響下，產(chǎn)生一系列基因突變，優(yōu)勢克隆發(fā)生“進化”，或者從亞克隆中“選擇”出新的優(yōu)勢克隆，從而逃逸不良“環(huán)境”，不斷增殖并導致病情反復。其中，基因的不穩(wěn)定性是導致克隆演變的基礎，而化療等關鍵因素的選擇作用是克隆演變的動力。CLL在本質(zhì)上是一類不可治愈的惰性增殖性疾病，在漫長發(fā)展過程中終將走向復發(fā)/進展；這一過程涉及多種基因的突變、缺失、易位，甚至表觀遺傳學調(diào)控[25]，并從多方面影響腫瘤細胞的增殖、凋亡等生物學特征；克隆異質(zhì)性廣泛存在于腫瘤發(fā)展的各個階段，對優(yōu)勢克隆及亞克隆遺傳特征的充分重視有助于合理選擇用藥，有效避免復發(fā)。優(yōu)勢克隆的演變及其與非優(yōu)勢克隆之間的此消彼長是耐藥的根源，而目前得到公認的CLL克隆演變模式主要包括線性模式及分支模式；對克隆模式發(fā)展方向及化療等關鍵影響因素和基因不穩(wěn)定性的研究，有望進一步為預測治療反應及疾病進展提供方向，并將對臨床實踐的總體治療選擇產(chǎn)生重大的指導意義。

［1］D?hner H,Stilgenbauer S,Benner A,et al.Genomic aberrations and survival in chronic lymphocytic leukemia [J].N Engl JMed,2000,343(26):1910-1916.

［2］Rossi D,Rasi S,Spina V,et al.Integrated mutational and cytogenetic analysis identifies new prognostic subgroups in chronic lymphocytic leukem ia[J].Blood,2013, 121(8):1403-1412.

［3］Stilgenbauer S,Schnaiter A,Paschka P,et al.Genemutations and treatment outcome in chronic lymphocytic leukem ia:results from the CLL8 trail[J].Blood,2014,123 (21):3247-3254.

［4］Baliakas P,Hadzidim itriou A,Sutton LA,et al.Recurrent mutations refine prognosis in chronic lymphocytic leukem ia[J].Leukem ia,2015,29(2):329-336.

［5］Dam le RN,Wasil T,Fais F,et al.IgV genemutation status and CD38 expression as novel prognostic indicators in chronic lymphocytic leukemia[J].Blood,1999,94(6): 1840-1847.

［6］Greaves M,Maley CC.Clonal evolution in cancer[J]. Nature,2012,481(7381):306-313.

［7］Brown R.The treatment of relapsed refractory chronic lymphocytic[G].Hematology Am Soc Hematol Educ Program,2011:110-118.

［8］Janssens A,van Roy N,Poppe B,et al.High-risk clonal evolution,in chronic B-lymphocytic leukem ia:singlecenter interphase fluorescrnce in situ hybridization study and review of the literature[J].Eur JHaematol,2012,89 (1):72-80.

［9］Zhang L,Znoyko I,Costa LJ,et al.Clonal diversity analysis using SNP m icroarray:a new prognostic tool for chronic lymphocytic leukem ia[J].Cancer Genet, 2011,204(12):654-665.

［10］Braggio E,Kay NE,van Wier S,et al.Longitudinal genome-w ide analysis of patients w ith chronic lymphocytic leukem ia reveals complex evolution of clonal architecture at disease progression and at the time of relapse [J].Leukemia,2012,26(7):1698-1701.

［11］Puente XS,Pinyol M,Quesada V,et al.Whole-genome sequencing identifies recurrentmutations in chronic lymphocytic leukemia[J].Nature,2011,475(7354):101-105.

［12］Qucsadu V,Conce L,Viliamor N,et al.Exome sequencing identifies recurrent mutations of the splicing factor SF3B1 gene in chronic lymphocytic leukemia[J]. Nat Genet,2012,44(1):47-52.

［13］Rossi D,Fangazio M,Rasi S,et al.Disruption of BIRC3 associates w ith fludarabine chemofractoriness in TP53 w ild-type chronic lymphocytic leukem ia[J]. Blood,2012,119(12):2854-2862.

［14］Rossi D,Rasi S,Fabbri G,et al.Mutations of NOTCH1 are an independent predictor of survival in chronic lymphocytic leukem ia[J].Blood,2012,119(2): 521-529.

［15］Ouillette P,Sayiya-Cork K,Seymour E,et al.Clonal evolution,genomic drivers,and effects of therapy in chronic lymphocytic leukemia[J].Clin Cancer Res, 2013,19(11):2893-2904.

［16］Schuh A,Becq J,Humphray S,et al.Monitoring chronic lymphocytic leukemia progression by whole genome sequencing reveals heterogenous clonal evolution patterns[J].Blood,2012,120(20):4191-4196.

［17］Landau DA,Carter SL,Stojanov P,et al.Evolution and impact of subclonal mutations in chronic lymphocytic leukem ia[J].Cell,2013,152(4):714-726.

［18］Rossi D,Khiabanian H,Spina V,et al.Clinical impact of small TP53 mutated subclones in chronic lymphocytic leukem ia[J].Blood,2014,123(14):2139-2147.

［19］Ojha J,Ayres J,Secreto C,et al.Deep sequencing identifies genetic heterogenity and recurrent convergent evolution in chronic lymphocytic leukem ia[J].2015,125 (3):492-498.

［20］de Sousa E Melo F,Vermeulen L,Fessler E,et al.Cancer heterogeneity－－ a multifaced view[J].EMBO Rep,2013,14(8):686-695.

［21］Murugaesu N,Chew SK,Swanton C.Adapting clinical paradigms to the challenges of cancer clonal evolution [J].Am JPathol,2013,182(6):1962-1971.

［22］Messina M,Del Giude I,Khiabanian H,etal.Genetic lesions associated w ith chronic lymphocytic leukemia chemo-refractoriness[J].Blood,2014,123(15):2378-2388.

［23］Warner JL,Arnason JE.Alem tuzumab use in relapsed and refractory chronic lymphocytic leukemia:a history and discussion of future rational use[J].Ther Adv Hematol,2012,3(6):375-389.

［24］Hallek M.Signaling the end of chronic lymphocytic leukem ia:new frontline treatment stratiges[J].Blood, 2013,122(23):138-150.

［25］Sampath D,Liu C,Vasan K,et al.Histone deacetylases mediate the silencing of m iR-15a,m iR-16,and m iR29b in chronic lymphocytic leukem ia[J].Blood,2012,119 (5):1162-1172.

R733.7

A

10.11877/j.issn.1672-1535.2015.13.03.02

#通信作者（corresponding author），e-mail：zengjunli@163.com

2015-03-31）