吳葉蓮，肖春玲

（山西師范大學(xué)工程學(xué)院，山西臨汾041004）

酶解法提取黑米多糖的研究

吳葉蓮，肖春玲*

（山西師范大學(xué)工程學(xué)院，山西臨汾041004）

以去皮脫脂的黑米為原料，研究了纖維素酶對黑米中多糖的提取率的影響，實驗采用單因素試驗法研究了在酶解濃度、酶解溫度、酶解時間、pH值4個因素下對黑米多糖提取率的影響，選出了影響較大的3個因素；然后用星點設(shè)計優(yōu)化法對實驗數(shù)據(jù)進行進一步優(yōu)化，確定了最優(yōu)的提取工藝參數(shù)。結(jié)果表明：在pH6.0，酶解溫度52℃，酶解時間2.5 h，酶濃度3mg/100mL的條件下，黑米多糖得率為0.435 3%。各因素對多糖得率的影響依次為酶解時間＞pH＞酶解溫度。

黑米；多糖；酶解法；星點設(shè)計優(yōu)化法

黑米外表墨黑，營養(yǎng)豐富，有“黑珍珠”和“世界米中之王”的美譽[1]。黑米的主要營養(yǎng)成分（糙米），按占干物質(zhì)計，含粗蛋白質(zhì)8.5%～12.5%，粗脂肪2.7%～3.8%，碳水化合物75%～84%，粗灰分1.7%～2%[2]。含有大米所缺乏的VC、葉綠素、花青素、胡蘿卜素及強心甙等特殊成分，此外，還含有多種維生素和鋅、鐵、鉬、硒等必需微量元素[3]。用黑米熬制的米粥香甜滋潤，軟糯適口，營養(yǎng)豐富，是滋補、養(yǎng)顏的必備良方。

現(xiàn)在人們對黑米中的花青素的提取、純化及其體內(nèi)抗氧化活性研究研究比較清楚，但對黑米中的多糖的提取的研究還少見報道。目前多糖提取主要采用熱水浸提、堿浸提、酸浸提[4]等化學(xué)方法。而隨著生物技術(shù)的發(fā)展，酶的來源愈來愈多[5]。本項目擬研究用酶解法提取黑米多糖，以期為黑米的進一步開發(fā)利用提供參考。

1材料和方法

1.1 材料與試劑

黑米購于北京群鑫工貿(mào)有限公司；無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，纖維素酶（30 u/mg）購于華科生化試劑商城；石油醚、無水乙醇、乙醇（95%）、濃硫酸、苯酚、檸檬酸和氨水均為國產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器

pHS-3TC精密數(shù)顯酸度計：上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司；FA-1004型電子天平、RJ-TDL-40C臺式低速大容量離心機：上海精科實業(yè)有限公司；UV-1100型紫外可見分光光度計：金城市金城國勝實驗儀器廠。

1.3 方法

去皮脫脂黑米粉的制備：選擇優(yōu)質(zhì)的黑米于45℃水中浸30min，在65℃下烘干，用高速粉碎機磨粉，過60目篩得粉末，用石油醚脫脂，常溫下干燥并保存。

多糖含量的測定：采用苯酚-硫酸法[6]測定黑米中多糖的含量。建立的回歸方程為：y=0.056 5x-0.006 2，（R2=0.999 7，0μg/mL～14μg/mL），其中橫坐標(biāo)表示葡萄糖濃度，縱坐標(biāo)表示吸光度。多糖的得率%=粗提物中含有的多糖質(zhì)量/最初黑米粉的質(zhì)量×100%[7]。

酶解法提取黑米多糖的過程：稱取1 g黑米粉于100mL燒杯中，定容到50mL混勻。加入酶并調(diào)節(jié)不同的pH、溫度、濃度、時間。在黑米粉溶液中加入6mL[8]的酶溶液，于水浴鍋中加熱反應(yīng)2 h，調(diào)節(jié)至90℃歷時30min，使酶鈍化，在3000 r/min的條件下離心10min[9]，取出溶液的上清液，加入95%的乙醇溶液靜置，確保充分沉淀。去掉上清液，再次用相同轉(zhuǎn)速離心剩下的液體歷時15min。用無水乙醇洗滌沉淀，干燥后得到粗多糖。最后，用蒸餾水溶解粗多糖，加入5mL苯酚、1mL硫酸搖勻，測其吸光度。

提取黑米多糖的單因素試驗：分別考察pH（1.0、3.0、5.0、7.0、9.0、11.0）、酶解溫度（30、40、50、60、70、80℃）、酶解時間（1、2、3、4、5、6 h）、酶濃度（0、1、2、3、4、5mg/100mL）對黑米多糖提取率的影響[10]。

酶解法提取黑米多糖的星點優(yōu)化設(shè)計實驗[11]：根據(jù)單因素實驗的結(jié)果，從4個因素中篩選出3個影響多糖得率較大的因素。使用響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計軟件對這3個因素進行優(yōu)化分析，進一步確定黑米多糖的最佳提取工藝參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 不同pH對黑米多糖得率的影響

圖1表示不同pH條件下黑米多糖的得率。

圖1 不同pH條件下黑米多糖的得率Fig.1 The yield of black rice polysaccharide in different pH

圖1表明，黑米多糖的得率是隨著pH的變大在逐漸增大，當(dāng)pH增加到6.0時，出現(xiàn)最高值。pH繼續(xù)增大得率反而下降，這是因為pH的大小直接影響酶活性，酶活性下降，將直接導(dǎo)致多糖得率下降[12]。因此影響黑米多糖酶解的最適pH是6.0。

2.1.2 酶解溫度對黑米多糖得率的影響

圖2表示不同溫度下黑米多糖的得率。

圖2 不同溫度條件下黑米多糖的得率Fig.2 The yield of black rice polysaccharide in different temperature

圖2 顯示，隨著溫度的升高，多糖的得率變大，50℃時多糖的得率達(dá)最大值0.101 4%，但隨著溫度的持續(xù)升高，多糖的得率反而降低。因為溫度既會影響多糖的浸出速度，還將影響酶的活性的大小[13]，由此多糖的最佳酶解溫度為50℃。

2.1.3 酶解時間對黑米多糖得率的影響

圖3表示了不同酶解時間下黑米多糖的得率。

圖3 不同時間條件下黑米多糖的得率Fig.3 The yield of black rice polysaccharide in different time

從圖3看出，多糖的得率在2 h出現(xiàn)了最高值達(dá)0.142 7%。如果繼續(xù)增加反應(yīng)時間，多糖的得率反而會下降，這是因為反應(yīng)時間越長，反應(yīng)越充分，但是并不是多糖的得率會越大。因此黑米多糖的最佳酶解時間為2 h。

2.1.4 酶濃度對黑米多糖得率的影響

圖4表示不同酶濃度對黑米多糖得率的影響。

圖4 不同酶濃度下黑米多糖的得率Fig.4 The yield of black rice polysaccharide in different concentration

從圖4看出，黑米多糖的得率會隨著酶濃度的增加而逐漸增加，當(dāng)濃度達(dá)到3mg/100mL的時候，多糖的得率為最大達(dá)到0.1297%。濃度繼續(xù)增加多糖的得率并沒有增大。因此黑米多糖的最佳酶濃度為3mg/100mL。2.2 星點優(yōu)化設(shè)計試驗

2.2.1 實驗設(shè)計

根據(jù)上述單因素的試驗結(jié)果，選擇纖維素酶最適酶濃度為3mg/100mL，確定對多糖得率產(chǎn)生影響較大的X1（pH）、X2（酶解溫度）和X3（酶解時間），以多糖得率Y為考察指標(biāo)來進行三因素五水平的星點設(shè)計（CCD）[14]，其中因素和水平見表1。

表1 星點設(shè)計因素水平表Table1 Ariables and codes of central composite design

2.2.2 星點試驗設(shè)計結(jié)果

星點實驗結(jié)果見表2。

表2 星點實驗設(shè)計及結(jié)果Table2 Factors and response of central composite design

表3 回歸模型方差分析表Table3 Regression model analysis of variance table

用軟件Design Expert8.0.6分析處理數(shù)據(jù)，得方程Y=0.43＋0.019X1＋0.018X2＋0.049X3-0.011X1X2＋3.938E-003X1X3＋0.017 7X2X3-0.069X12-0.082X22-0.056X32。其中：Y為多糖得率的預(yù)測值；X1為pH的編碼值；X2為酶解溫度的編碼值；X3為酶解時間的編碼值。進一步優(yōu)化得X1=0.14，X1=0.15，X3=0.46，Y=0.441 0%，由表3知，回歸模型P值＜0.05，可知該模型顯著；模型失擬項不顯著，說明選擇該模型合適。因素X1（pH）、X2（酶解溫度）、X3（酶解時間）及X1X2、X2X3、X1X3對黑米多糖得率的交互影響是不顯著的，X12、X32的影響是顯著的，X22的影響是極顯著的。這說明實驗中的各個因素與數(shù)值之間未表現(xiàn)出簡單的線性關(guān)系。由單因素F值的大小可判斷，各因素對黑米多糖得率的影響順序為：酶解時間＞pH＞酶解溫度。

經(jīng)過分析可知，采用纖維素酶法提取黑米多糖的最佳條件為pH6.14，酶解溫度51.5℃，酶解時間2.46 h，黑米多糖得率為0.441 0%。為了實際操作方便，黑米多糖的最佳提取條件為pH6.0，酶解溫度為52℃，酶解時間為2.5 h，然后進行實驗驗證多糖的得率為0.435 3%，與理論值的接近程度為98.71%。實驗優(yōu)化得到的參數(shù)可行，進一步驗證了數(shù)學(xué)回歸的可行性。

3 結(jié)論

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，對纖維素酶的提取參數(shù)采用星點設(shè)計實驗優(yōu)化，所得結(jié)果為：在pH6.0，酶解溫度52℃，酶解時間2.5 h，酶濃度3mg/100mL，在此條件下，黑米多糖的理論得率為0.435 3%。由星點曲面和等高線圖可知，pH、酶解溫度、酶解時間對多糖得率的影響的強弱順序依次為酶解時間＞pH＞酶解溫度。

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Research on Extraction of Black Rice Polysaccharide by Enzymolysis Method

WUYe-lian，XIAOChun-ling*
（College of Engineering，Shanxi Normal University，Linfen 041004，Shanxi，China）

This experiment took black rice as raw material and used the cellulose enzymatic on the extraction of black rice polysaccharide.The single-factor test methods were used to investigate the influence of enzyme concentration，reaction temperature，hydrolysis time and pH.Based on it，three main influence factors are chosen.The experiment data were further optimized using the central composite design and the optimal parameters of the extraction process was determined.The results show that：The optimal parameters of extraction process are：pH is 6.0，reaction temperature is 52℃，hydrolysis time is 2.5 h and the enzyme concentrationis 3mg/100mL.Uunder this condition，polysaccharide content in black rice is 0.435 3%.Effects of different factors on the polysaccharide yield are distinct and the order is：enzymatic hydrolysis time＞pH＞hydrolysis temperature.

black rice；polysaccharide；enzymatic hydrolysis；central composite design

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.06.010

2013-10-06

山西師范大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新項目（SD2012CXSY-48）；山西師范大學(xué)科研課題組（873041）

吳葉蓮（1992—），女（漢），本科，學(xué)士，研究方向：食品科學(xué)。

*通信作者：肖春玲（1966—），教授，碩士，研究方向：天然產(chǎn)物的提取。