陳中強(qiáng)，翟　瑩，尚萍萍，左正宇，李　琦，劉志國

(武漢輕工大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430023)

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膽固醇對高脂誘導(dǎo)的非酒精性脂肪肝病的影響

陳中強(qiáng)，翟瑩，尚萍萍，左正宇，李琦，劉志國

(武漢輕工大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430023)

摘要：研究膽固醇含量對高脂誘導(dǎo)的非酒精性脂肪肝病(NAFLD)的影響。對成年SD雄性大鼠隨機(jī)分為正常組(CON)和高脂飲食誘導(dǎo)NAFLD組(HF),HF組下分HFC0、HFC1、HFC2和HFC5組，分別對應(yīng)飼料中添加0%、1%、2%和5%的膽固醇，各組于飼養(yǎng)4周和8周結(jié)束時(shí)斷頭取血，檢測血清TC、TG含量和ALT、AST活性，對8周的肝組織切片HE染色。結(jié)果顯示與對照組相比，隨著膽固醇攝入量增加，飼喂8周的大鼠體重、肝重及肝比重增加明顯；肝形態(tài)改變明顯，細(xì)胞脂質(zhì)聚積和炎性浸潤顯著；HFC2、HFC5組于4周時(shí)血TC含量、ALT及AST升高顯著。研究結(jié)果表明：高膽固醇飲食可加重肝脂質(zhì)聚積、肝功能異常，并促進(jìn)了非酒精性脂肪肝病的發(fā)展。

關(guān)鍵詞：NAFLD；膽固醇；脂質(zhì)聚積

1引言

非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是指除酒精和其他明確的損肝因素所致的，以彌漫性肝細(xì)胞大泡性脂肪變性為主要特征的臨床病理綜合征，包括非酒精性單純性脂肪肝(NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)和肝硬化[1]。流行病學(xué)研究顯示，全球NAFLD發(fā)病率逐年上升，發(fā)病年齡也日趨年輕化，已成為當(dāng)今主要的慢性肝病[2]。NAFLD的發(fā)病機(jī)制迄今還沒有完全闡明，普遍接受的是Day和James的“二次打擊”學(xué)說[3]。近些年來，隨著人們的生活水平不斷提高，日常膳食膽固醇所占比例亦大大增加，但膽固醇對NAFLD的具體影響并不十分清楚。

在NAFLD病理進(jìn)程中，膽固醇、甘油三脂等脂質(zhì)在肝細(xì)胞內(nèi)聚集是NAFLD發(fā)生發(fā)展的前提和必要條件[4-7]。研究表明，TG聚積本身對肝細(xì)胞損傷并不大，而細(xì)胞內(nèi)游離脂質(zhì)負(fù)荷過載，尤其是游離脂肪酸、游離膽固醇、神經(jīng)酰胺等脂質(zhì)成分，則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞功能失調(diào)和細(xì)胞凋亡等[8-10]。

本研究通過富含飽和脂肪酸和不同濃度膽固醇的飼料飼喂誘導(dǎo)NAFLD大鼠模型，探討高飽和脂肪酸條件下不同濃度膽固醇對NAFLD病程的影響。

2材料與方法

2.1　動(dòng)物

SD雄性大鼠(6周齡、體重為180—200 g )，購自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心。

2.2　試劑

膽固醇、膽酸鹽(美國sigma公司產(chǎn)品)；總膽固醇(TC)、總甘油三酯(TG)、ALT、AST檢測試劑盒均購置于南京建成生物研究所；蘇木精(BIOSHARP公司產(chǎn)品)；硫酸鋁鉀(天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心產(chǎn)品)；多聚甲醛(美國Celanese公司產(chǎn)品)；丙三醇(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品)；冰乙酸(分析純，湖北大學(xué)化工廠產(chǎn)品)；伊紅(Generay Biotech (Shanghai)公司產(chǎn)品)；豬油(上海嘉里糧油工業(yè)有限公司)。

2.3　儀器

酶標(biāo)儀(TECAN，DNA Expert),可見光分光光度計(jì)(上海尤尼柯儀器公司)，倒置顯微鏡(olympus),5424R高速低溫離心機(jī)(Eppendorf，Germany)，電子酸度計(jì)(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)

2.4　方法

2.4.1動(dòng)物分組及高脂誘導(dǎo)NAFLD

SD大鼠適應(yīng)性飼喂1周后，隨機(jī)分為5組，每組6-12只，分別為正常飲食飼喂的對照組(CON組)、高脂飼喂誘導(dǎo)NAFLD模型各組，即HFC0(20%脂肪)組、HFC1(20%脂肪+1%膽固醇)組、HFC2(20%脂肪+2%膽固醇)組和HFC5(20%脂肪+5%膽固醇)組。

2.4.2飼料配方

各實(shí)驗(yàn)組大鼠飼料成分比率如表1所示。

表1　各實(shí)驗(yàn)組大鼠飼料成分比率　/%

2.4.3動(dòng)物處理及樣本采集

飼喂4周和8周結(jié)束時(shí)，大鼠禁食24h，自由飲水，稱重，斷頭取血，2 000 rpm離心取上清，備檢測用。肝組織稱重，取肝右大葉相同部位組織用多聚甲醛固定，石蠟包埋并切片，一部分液氮速凍置于-80 ℃冰箱保存。

2.4.4血脂及肝功能檢測

檢測TG、TC的含量和ALT、AST的活性，方法按照試劑盒提供說明書進(jìn)行。

2.4.5HE染色

對各組大鼠相同部位的肝切片進(jìn)行蘇木精和伊紅染色處理，觀察肝形態(tài)結(jié)構(gòu)。

2.4.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3結(jié)果

3.1　大鼠體重、肝重、肝比重

大鼠飼喂8周后，高脂組大鼠體重、肝重、肝比重，隨著膽固醇濃度的增加，逐步升高。與CON組相比，體重、肝重均從HFC2組開始有顯著差異，而肝比重則從HFC1組開始有顯著差異(P<0.05)，如圖1所示。

圖1　18周后大鼠體重、肝重、肝比重變化(n=6, a: vs CON, P<0.05)

3.2　大鼠肝臟顏色和質(zhì)地變化

CON組大鼠肝臟形態(tài)正常，無腫脹，色澤深紅有光澤，質(zhì)軟，邊緣銳利。HFC0組大鼠肝臟色澤無明顯變化，無油膩感，體積略有增大。HFC1組體積進(jìn)一步增大，色澤微黃，切面油膩。HFC2組較HFC1組體積進(jìn)一步增大，色澤變黃，邊緣圓鈍，組織松脆。HFC5組肝臟體積明顯增大，整體色澤土黃，油膩感，有明顯脂肪斑塊(圖2)。

圖2　8周后各組大鼠肝臟顏色和質(zhì)地變化

3.3　血清TG、TC含量變化

大鼠飼養(yǎng)4周和8周后，高脂組大鼠血清中TG、TC的含量，隨著膽固醇濃度的增加逐步升高。與CON組相比， 4周的TC從HFC2組開始有顯著差異，8周的TC從HFC1組開始有顯著差異 (P<0.05)，如圖3所示。

圖3　4周和8周各組大鼠血清TC和TG含量(n=6, a: vs CON, P<0.05)

3.4　血清ALT、AST活性變化

大鼠飼養(yǎng)4周和8周后，HFC2和HFC5組大鼠血清中ALT、AST活性增加顯著(P<0.05)(圖4)。

圖4　4周和8周大鼠血清ALT、AST活性(n=6, a: vs CON, P<0.05)

3.5　肝結(jié)構(gòu)形態(tài)觀察

HE染色顯示，大鼠飼喂8周后，CON組大鼠肝細(xì)胞呈放射狀整齊排列，胞核及胞質(zhì)染色清晰，細(xì)胞形態(tài)正常，肝竇無擴(kuò)張。HFC0組大鼠可見肝竇微有擴(kuò)張，肝小葉結(jié)構(gòu)正常，無明顯炎性細(xì)胞浸潤。HFC1組大鼠可見肝腺泡區(qū)部分肝細(xì)胞胞脂肪變，肝細(xì)胞索欠清晰，且肝腺泡區(qū)內(nèi)有散在個(gè)別點(diǎn)灶狀壞死。HFC2組大鼠肝細(xì)胞索進(jìn)一步模糊，有較多脂滴沉積，肝腺泡區(qū)內(nèi)點(diǎn)灶狀壞死增多。HFC5組肝細(xì)胞索模糊乃至消失，出現(xiàn)明顯氣球樣變，可見細(xì)胞核被脂滴擠壓至細(xì)胞邊緣，腺泡內(nèi)點(diǎn)灶狀壞死明顯(圖5)。

圖5　8周結(jié)束后各組大鼠肝組織切片HE染色結(jié)果(×400)

4結(jié)論

各高脂組大鼠飼喂8周后，肝指數(shù)、血脂及肝酶活性指標(biāo)升高明顯，HE染色結(jié)果顯示高脂高膽固醇飲食肝臟脂質(zhì)聚積、炎性浸潤明顯，表明高脂飲食成功誘導(dǎo)了大鼠NAFLD模型。隨著飼料中膽固醇含量的增加，肝指數(shù)、血脂及肝酶活性指標(biāo)都相應(yīng)升高，脂質(zhì)聚積和炎性浸潤相應(yīng)加重，表明飼料中膽固醇含量的增加能夠促進(jìn)NAFLD病程的進(jìn)展。同時(shí)結(jié)果也表明膽固醇和富含飽和脂肪酸的甘油三酯兩者的聯(lián)合作用對肝的損傷要遠(yuǎn)超出單獨(dú)的甘油三酯對肝的影響，其具體機(jī)理有待進(jìn)一步探討。

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Effect of cholesterol on nonalcoholic fatty liver disease induced by high-fat

CHENZhong-qiang，ZHAIYing，SHANGPing-ping，ZUOZheng-yu，LIQi，LIUZhi-guo

(School of Biology and Pharmaceutical Engineering, Wuhan Polytechnic University,Wuhan 430023,China)

Abstract：To research the effect of cholesterol content on the nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) induced by high fat.Method：The adult male SD rats were randomly divided into the normalgroup (CON) and high-fat diet group (HF).Then the HF group was divided into HFC0, HFC1, HFC2 and HFC5 group, and 0%, 1%, 2% and 1% cholesterol were added into the five HFC groups correspondingly. All rats were beheaded at the 4thand 8thweek, and the organ blood was collected to detect the contentsof the totalcholesterol (TC), the total triglyceride (TG) and the activities of Alanineaminotransferase (AST), Alanine transaminase(ALT).The 8thweeks’ liver tissues embedded inparaffin were stained with hematoxylin and eosin (H&E) to judge inflammatorysituation.Result：After 8 weeks’feeding,compared with the CON group, the body weight, liver weight and the proportion of liver and body weight of the HFC group rats increased significantly with the increase of cholesterol intake. And the liver morphology changes, lipid accumulation and inflammatory infiltration could be easily observed on HFD liver cells. At the 4thweek, the content of TC, activities of ALT and AST increased significantly in the HFC2 and HFC5 group.Conclusion：The results showed the high cholesterol diet can aggravate hepatic lipid accumulation, liver dysfunctionand promote the development of nonalcoholic fatty liver disease.

Key words：NAFLD; cholesterol;lipid accumulation.

DOI:10.3969/j.issn.2095-7386.2015.02.011

文章編號：2095-7386(2015)02-0047-03

通信作者：徐翔(1962-)，男，主任醫(yī)師，E-mail：498376463@qq.com.

作者簡介：韓馮(1981-)，女，碩士，主治醫(yī)師，E-mail：3348459@qq.com.

收稿日期：2015-03-08.

中圖分類號：R 575.5

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A