陳　瑾,陳　丹,劉曉紅,繆禮鴻

(武漢輕工大學 生物與制藥工程學院，湖北 武漢 430023)

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耐高溫馬克斯克魯維酵母菌劑固體發(fā)酵工藝優(yōu)化

陳瑾,陳丹,劉曉紅,繆禮鴻

(武漢輕工大學 生物與制藥工程學院，湖北 武漢 430023)

摘要：以干燥菌劑中的活菌數(shù)為指標，通過單因素實驗和正交實驗對耐高溫馬克斯克魯維酵母HY32-1的固體發(fā)酵工藝進行優(yōu)化。結(jié)果表明，最佳培養(yǎng)基為：以麩皮97.3%、糖蜜1%、酵母粉0.5%、脫脂奶粉0.5%，尿素0.1%、KH2PO40.5%、MgSO4·7H2O 0.1%為發(fā)酵基質(zhì)，并采用3倍濃度YPD加富培養(yǎng)液代替固體發(fā)酵培養(yǎng)基中20%水分。菌劑的最佳發(fā)酵和制備條件為：發(fā)酵時間30 h、發(fā)酵溫度37 ℃、培養(yǎng)基含水率50%，發(fā)酵后干燥溫度45 ℃。優(yōu)化后所制備的HY32-1固體菌劑活菌數(shù)高達 3.7×108cfu/g，比優(yōu)化前的活菌數(shù)提高了77.9%。

關(guān)鍵詞：馬克斯克魯維酵母；固體發(fā)酵；工藝優(yōu)化

1引言

馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)是目前研究較為廣泛的一種非傳統(tǒng)酵母，因其耐高溫、生長速率快、底物譜廣等諸多優(yōu)勢而越來越多地應用于工業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域[1-2]。此外，馬克斯克魯維酵母還可以利用菊粉類原料、乳清、糖蜜以及木糖等多種非糧底物生產(chǎn)乙醇，是一種具有潛力的生物乙醇發(fā)酵菌株[3-5]。在發(fā)酵工藝方面，固態(tài)發(fā)酵由于其具有能耗低、廢液少、產(chǎn)品分離成本低、不存在二次污染、發(fā)酵條件相對比較開放、設(shè)備要求簡單等優(yōu)點，被廣泛用于生物農(nóng)藥、農(nóng)副產(chǎn)品的綜合利用以及酶制劑生產(chǎn)等方面[6-7]。因此，筆者對耐高溫馬克斯克魯維酵母菌固體發(fā)酵條件及菌劑制備工藝進行了研究，為該菌種的應用提供了良好基礎(chǔ)。

2材料與方法

2.1　材料

2.1.1實驗菌種

耐高溫馬克斯克魯維酵母HY32-1，由本實驗室分離和保存。

2.1.2培養(yǎng)基

酵母菌種子液培養(yǎng)基：采用YPD培養(yǎng)基[8]。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：麩皮：97.3%(w/w)、糖蜜1%、酵母粉0.5%、脫脂奶粉0.5%，尿素0.1%、KH2PO40.5%、MgSO4·7H2O 0.1%。

加富發(fā)酵培養(yǎng)基：在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上分別用3倍、5倍濃度的YPD(蔗糖代替葡萄糖)代替培養(yǎng)基中20%水分，其它成分不變。

根據(jù)試驗配方稱取發(fā)酵培養(yǎng)基原料裝入250 mL三角瓶中，裝料量為100 g，121℃滅菌25min，冷卻至室溫備用。

2.2　實驗方法

2.2.1酵母菌活化

將實驗室保存的馬克斯克魯維酵母HY32-1接種于YPD固體培養(yǎng)基活化培養(yǎng)36 h，再轉(zhuǎn)接至YPD液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫搖床170 r/min培養(yǎng)24 h。

2.2.2馬克斯克魯維酵母生長曲線的繪制

挑取YPD平板上的馬克斯克魯維酵母單菌落，接種至100 mL YPD液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫搖床170 r/min培養(yǎng)，每隔2 h取樣，用分光光度計在600 nm波長條件下測定OD值，并繪制馬克斯克魯維酵母生長曲線。

2.2.3馬克斯克魯維酵母固體菌劑的制備工藝

將馬克斯克魯維酵母種子液按10%接種量接種到固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)30 h后，置45 ℃鼓風干燥箱中，干燥至含水率為12%左右時取樣測定樣品的活菌數(shù)。以每克發(fā)酵干料中測定的活菌計數(shù)，單位為cfu/g。

2.2.4單因素試驗

單因素試驗分別考察培養(yǎng)基組成及水分、發(fā)酵時間、干燥溫度、干燥后菌劑的最終含水率對活菌數(shù)的影響等。

2.2.5正交試驗

根據(jù)單因素的試驗結(jié)果，選擇發(fā)酵時間、含水率、培養(yǎng)基進行3因素2水平的正交試驗，以活菌數(shù)為指標，確定馬克斯克魯維酵母菌劑的最佳發(fā)酵工藝參數(shù)。

表1正交試驗因素與水平

水平A發(fā)酵時間/hB含水率/%C加富13045不加富240503倍

2.2.6酵母菌計數(shù)

酵母菌總菌數(shù)計數(shù)采用血球計數(shù)板技術(shù)法；活菌數(shù)計數(shù)采用稀釋平板涂布法測定[8]。

酵母菌劑的復活條件及測數(shù)方法：實驗組干燥后菌劑樣品加至1%蔗糖水中，于37 ℃搖床170 r/min復活30 min；空白組干燥后菌劑樣品加至無菌水中，于37 ℃搖床170 r/min培養(yǎng)30 min。分別取樣測定樣品酵母菌活菌數(shù)。

3結(jié)果與分析

3.1　馬克斯克魯維酵母生長曲線的繪制

馬克斯克魯維酵母HY32-1生長曲線如圖1所示，其中0—4 h為延滯期，此時期酵母菌繁殖緩慢，所以O(shè)D值較低；4—10 h為生長對數(shù)期，此時期酵母菌生長繁殖旺盛，有較高的代謝活力；10—12 h為穩(wěn)定期，此時期菌體數(shù)量保持平穩(wěn)或略有增加。因此，選擇發(fā)酵時間為10—12h的菌液作為固體發(fā)酵的種子液。

圖1　馬克斯克魯維酵母 HY32-1生長曲線

3.2　發(fā)酵時間與發(fā)酵溫度對活菌數(shù)的影響

按10%的接種量將HY32-1種子液接種于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，混勻后分別在37 ℃和40 ℃下培養(yǎng)20 h、25 h、30 h和35 h，結(jié)果見圖2。由圖2可知，37 ℃培養(yǎng)時的酵母菌活菌數(shù)明顯比40 ℃下培養(yǎng)的活菌數(shù)高；并且隨著發(fā)酵時間的延長，活菌數(shù)總體上呈上升趨勢。結(jié)合發(fā)酵的效率性，選擇發(fā)酵溫度為37 ℃，發(fā)酵時間為30 h。

圖2　發(fā)酵時間和溫度對酵母菌活菌數(shù)的影響

3.3　培養(yǎng)基及菌劑含水率對酵母菌活菌數(shù)的影響

分別接種10%酵母菌種子液至含水率為45%和50%的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)30 h后分別置40 ℃、42 ℃下干燥，干燥后的活菌數(shù)測定結(jié)果見表2。由表2可知，培養(yǎng)基含水率為50%、干燥溫度為42 ℃時制備的菌劑活菌數(shù)最高。一般保存菌劑含水率在10%左右，當含水率低于5%時菌體會難以生存。

表2干燥溫度對菌劑中活菌數(shù)的影響/×108cfu·g-1

樣品編號含水率/%活菌數(shù)(干基)新鮮發(fā)酵料1號47.49.5922號51.210.45140℃干燥1號7.60.6982號8.00.57642℃干燥1號9.30.8002號9.51.055

注：1號含水率45%；2號：含水率50%。

3.4　干燥溫度、時間及復活條件對菌劑活菌數(shù)的影響

按10%接種量將酵母種子液與基礎(chǔ)固體發(fā)酵培養(yǎng)基混勻，于37 ℃發(fā)酵30 h后，分別于42 ℃、45 ℃干燥，每隔1 h測一次活菌數(shù)及含水率。由圖3可知：隨著干燥時間的延長培養(yǎng)基的含水率逐漸降低，相同的干燥時間內(nèi)42 ℃干燥后的含水率比45 ℃干燥后高。由圖4可知：45 ℃干燥后活菌數(shù)比42 ℃干燥后高，用1%蔗糖水復活的實驗組活菌數(shù)比空白對照組高。干燥溫度45 ℃，干燥時間1 h、復活30 min時酵母菌劑的活菌數(shù)最高。

圖3　培養(yǎng)基含水率與干燥溫度和干燥時間的關(guān)系

圖4　培養(yǎng)基含水率對活菌數(shù)的影響

3.5　加富培養(yǎng)對活菌數(shù)的影響

基礎(chǔ)固體發(fā)酵培養(yǎng)基中分別用3倍、5倍YPD(蔗糖代替葡萄糖)培養(yǎng)液代替20%的水分，另一組為不加富的空白對照，接種量均為10%，37 ℃培養(yǎng)30 h，每隔15 h攪拌一次。發(fā)酵結(jié)束后在45 ℃干燥，測活菌數(shù)(1%蔗糖水復活，條件同上)，所得結(jié)果如表3。由表3可知：加富5倍>加富3倍>不加富的對照，表明加富培養(yǎng)基能夠有效提高酵母菌的活菌數(shù)，但考慮到培養(yǎng)基成本，選擇3倍加富培養(yǎng)基進行正交試驗。

表3基礎(chǔ)培養(yǎng)基加富對活菌數(shù)的影響/×108cfu·g-1

試驗號新鮮發(fā)酵品含水率/%活菌數(shù)(干基)試驗號干燥品含水率/%活菌數(shù)(干基)0(CK)52.195.5430(CK)13.441.4213倍加富50.808.1303倍加富13.232.0805倍加富51.788.3995倍加富11.764.080

3.6　正交試驗

采用L4(23)正交試驗(表4)進一步優(yōu)化發(fā)酵條件中發(fā)酵時間、含水率、加富，試驗水平分別為發(fā)酵時間：30 h、40 h；含水率：45%、50%，YPD加富0倍(CK)、3倍，得到更優(yōu)組合。由結(jié)果分析可知：試驗的最優(yōu)方案為A1B2C2，即發(fā)酵時間30 h，含水率50%，加富3倍，并且各因素的影響程度為：含水率>加富培養(yǎng)>發(fā)酵時間。

表4　正交試驗　/×108 cfu·g-1

采用優(yōu)化的條件A1B2C2培養(yǎng)酵母，即基礎(chǔ)固體發(fā)酵培養(yǎng)基中加入3倍濃度YPD(蔗糖代替葡萄糖)代替20%水分、含水率50%，37 ℃培養(yǎng)30 h后45 ℃干燥至含水率為12%左右時，測得酵母菌的活菌數(shù)為3.7×108cfu/g(干基)，比優(yōu)化前的活菌數(shù)(2.08×108cfu/g)提高了77.9%。

4結(jié)論

通過單因素試驗和正交試驗，對耐高溫馬克斯克魯維酵母HY32-1固體發(fā)酵條件的優(yōu)化結(jié)果為：在含水率為50%條件下37 ℃下發(fā)酵30 h，然后在45 ℃條件下最終干燥至含水率為12%左右。適宜的固體發(fā)酵培養(yǎng)基各營養(yǎng)成分質(zhì)量分數(shù)分別為：麩皮97.3%、糖蜜1%、酵母粉0.5%、脫脂奶粉0.5%、尿素0.1%、KH2PO40.5%、MgSO4·7H2O 0.1%、3倍YPD(蔗糖代替葡萄糖培養(yǎng)液代替20%水分。培養(yǎng)結(jié)束后馬克斯克魯維酵母HY32-1的活菌達到3.7×108cfu/g，比優(yōu)化前的活菌數(shù)提高了77.9%。

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Optimization of the solid-state fermentation process for the multiplication of a thermotolerantKluyveromycesmarxianusstrain

CHENJin,CHENDan,LIUXiao-hong,MIAOLi-hong

(School of Biology and Pharmaceutical Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023,China)

Abstract：In order to improve the production of active cells by Kluyveromyces marxianus HY-32, the proportion of medium component and the treatment conditions were optimized by single factor test and orthogonal test. The result showed that, a maximal yield of cell amount could be obtained in the enrichment medium, which contains 96.4% wheat bran, 1% molasses, 0.5% yeast extract, 0.1% urea, 0.5% KH2PO4, 0.1% MgSO4·7H2O, and with 20% moisture replaced by three times YPD medium. The best treatment conditions were as follows: fermentation temperature 37 ℃, medium moisture 50%, culture time 30 h and drying at 45 ℃. Compared with the initial conditions, the optimized medium and treatment process resulted in a 77% increase in the active cells, which improved from 2.08 × 108cfu / g to 3.7 × 108cfu / g.

Key words：Kluyveromyces marxianus；solid-state fermentation；process optimisation

DOI:10.3969/j.issn.2095-7386.2015.02.003

文章編號：2095-7386(2015)02-0010-04

通信作者：胡中澤(1968-)，男，教授，E-mail: huzz1968@126.com.

作者簡介：牛芳(1990-)，女，碩士研究生E-mail: 1239686554@qq.com.

收稿日期：2015-01-28.

中圖分類號：TQ 939.97

文獻標識碼：A