楊 榮，劉 群，康蓮蓮，王 賽，韓金潭

藏藥綠蘿花水提物對小鼠免疫功能的影響

楊 榮，劉 群，康蓮蓮，王 賽，韓金潭

(西南民族大學生命科學與技術(shù)學院，四川 成都 610041)

探討藏藥綠蘿花對機體免疫功能的影響，為臨床合理用藥和進一步開發(fā)利用提供科學依據(jù).本研究以L9(34)正交設計試驗所獲得的綠蘿花水萃取干膏制劑為研究材料，以N2Hmice小白鼠為研究對象，以ConA誘導小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗(CCK-8法)、血凝和血凝抑制試驗及巨噬細胞吞噬試驗為研究方法，以(SI)刺激指數(shù)、(HI)新城疫抗體效價、吞噬百分率和吞噬指數(shù)為檢測指標，探討不同劑量綠蘿對機體免疫功能的影響.實驗結(jié)果顯示低劑量綠蘿花能夠增強小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬指數(shù)，其增強作用極顯著優(yōu)于空白組；低、中劑量綠蘿花組具有促進小鼠血清ND抗體產(chǎn)生的作用，作用顯著優(yōu)于空白組；低、中劑量綠蘿花組具有促進小鼠外周血淋巴細胞增殖的作用，作用顯著優(yōu)于空白組.研究結(jié)果表明低(1.08g/次/d，7d)、中(2.16g/次/d，7d)劑量綠蘿花對小鼠免疫功能具有增強作用.

藏藥綠蘿花；淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗；血凝和血凝抑制試驗；巨噬細胞吞噬試驗

藏藥綠蘿花[Scindapsusaureus(Linden ex Andre) Engl]是天南星科喜林芋屬植物綠蘿花的干燥花蕾[1]，產(chǎn)地在西藏寒冷地區(qū)及喜馬拉雅山脈一帶.據(jù)藏醫(yī)養(yǎng)身圖說》記載，藏藥綠蘿花具有治療高血壓、高血脂、糖尿病、冠心病、脈管炎、血管炎等[2].藏民將晾干后的綠蘿花泡水飲用，用以預防和治療糖尿病、高血脂等疾病.目前有關(guān)西藏綠蘿花的研究報道較少，主要集中于其化學成分的研究，如黃酮、揮發(fā)油、還原糖的提取分離、抗氧化和降血糖等藥理作用研究[1，3～9]，而其對機體免疫功能的影響尚未見報道.在中醫(yī)藥理論指導下，本研究結(jié)合藏地民間服用習慣和中藥總化學成分產(chǎn)生整體效應的觀點，以水煎干膏制劑為研究材料和N2Hmice小白鼠為研究對象，采用ConA誘導小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗(CCK-8法)、血凝和血凝抑制試驗、巨噬細胞吞噬試驗，并以黃芪多糖為陽性對照，研究不同劑量綠蘿花對小鼠細胞免疫功能、體液免疫功能、非特異性免疫功能的影響，現(xiàn)將研究結(jié)果報告如下.

1 材料

1.1 試驗動物

N2Hmice小白鼠，體重20±2g，雄性，由四川大學實驗動物中心提供(合格證號:NO.0010780).

1.2 主要試劑及儀器

黃芪多糖口服液(北京普爾路威達獸藥有限公司，批號:獸藥字(2009)010045231)；刀豆素蛋白A (ConA)(Sigma公司，批號:20110108165)；雞新城疫La Sota活毒凍干疫苗(北京信得威特科技公，批號: 201204001)；Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒(日本同仁化學研究所，批號:EST82)；小鼠外周血淋巴細胞分離液(天津灝洋生物制品科技公司，批號: 20121128)；改良型RPMI-1640培養(yǎng)基(賽默飛世爾生物化學制品公司，批號:NXL0745；自配無 Ca2+、Mg2+Hank，s液，PBS，1%雞紅細胞懸液，5%雞紅細胞懸液，6%淀粉肉湯.CASY TT型快速細胞分析儀(Scharfe System公司)；Model 680型酶聯(lián)免疫檢測儀(Bio-Rad公司).

2 方法

2.1 綠蘿花水提干膏口服液的制備

采用L9(34)正交表設計實驗，以水提干膏得率為考察指標.優(yōu)化后的水萃取工藝為:浸泡時間0.5h、加水量20倍、煎煮時間1h、煎煮次數(shù)4次，所得到干膏率為23.11%，將其換算成生藥含量并分別配制成2g/m l、1g/ml、0.5g/ml濃度的口服液，4℃冰箱保存.

2.2 試驗動物分組及處理

小鼠適應性喂養(yǎng)5天后，將60只N2Hmice小鼠隨機分為5組，按每天灌胃口服液濃度分為綠蘿花低(0.5g/ml)、中(1 g/m l)、高(2g/ml)劑量組和黃芪多糖組(0.5g/ml)及空白組(0.5g/ml)，每組12只，在環(huán)境為SPF級實驗動物房隔籠飼養(yǎng).各組處理如下:

各組在最后一次灌胃12h后，每只小鼠均肌肉注射雞新城疫La Sota活毒凍干疫苗2頭份.

2.3 試驗樣品的制備

各組實驗動物在最后一次灌胃后的第7d、14d、21d，眼眶靜脈叢采血0.2～0.5mL制備血清，用于雞新城疫抗體測定；眼眶采血0.5m l，分離收集中間層淋巴細胞懸液，Hank's液洗滌細胞2次，沉淀備用，用于小鼠外周血淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗；以枸櫞酸鈉為抗凝劑現(xiàn)用現(xiàn)配成1%雞紅細胞懸液、5%雞紅細胞懸液.

2.4 小鼠外周血淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗

四是創(chuàng)新人才匱乏，人才結(jié)構(gòu)性矛盾突出。目前，東營市擁有各類科技人員18.6萬人，但大多數(shù)分布在油田、石油大學以及教育、衛(wèi)生系統(tǒng)，而企業(yè)自有一線研發(fā)人員不能充分滿足技術(shù)創(chuàng)新需要，具有特殊專業(yè)技能的高層次人才匱乏，科技創(chuàng)新后勁需進一步加強。

CCK-8測定條件的選取參考王洪鴿等[10]的L9(34)正交表設計試驗，優(yōu)化后的CCK-8測定條件為:細胞數(shù)為1×106個/孔、ConA濃度為5ug/m l、細胞培養(yǎng)時間為48h，加入CCK-8后培養(yǎng)時間為4h.

ConA誘導的小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗參考侯春梅等[11]和林忠寧等[12]實驗方法:以肝素鈉為抗凝劑，無菌操作取小鼠眼眶靜脈叢血0.5ml，按Ficoll密度梯度離心法分離外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)懸液[13].洗滌離心 PBMC，用無菌改良型1640完全培養(yǎng)基(組成:100 U/ml的青霉素、25 mmol/L的l-谷氨酰胺、0.1 ml/ml的小牛血清和100 ug/ml的鏈霉素)混勻，計數(shù)并配制成106個/m l單細胞懸液.參考趙世云等[14]的實驗方法，以組為單位，將每份小鼠已分離得106/ml的PBMC懸液中取單細胞懸液(100 ul/孔)接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每份樣本分未刺激組和ConA組，并對應編號記錄，ConA組每孔均加入濃度為5ug/m l的ConA 10ul，未刺激組加入1640完全培養(yǎng)基10ul.另外設3孔有110 ul1640完全培養(yǎng)液和 3孔有 10ulConA 及100ul1640完全培養(yǎng)液空白對照.將培養(yǎng)板置于CO2體積分數(shù)為5%、溫度為37℃的培養(yǎng)箱里培養(yǎng)48 h.取出培養(yǎng)板，無菌條件下向各孔加入10ul的CCK-8溶液并小心混勻，繼續(xù)培養(yǎng)4h，用酶聯(lián)免疫檢測儀測定在450nm處的吸光度.計算對應小鼠樣本的刺激指數(shù).

2.5 血清抗體滴度測定

制備每組小鼠非抗凝血血清并標記編號，56℃水浴鍋中滅活30 min，參考王延樹[15]的血球凝集抑制試驗(HI)和微量血球凝集試驗(HA)方法來測定小鼠血清中的新城疫抗體效價.以100%抑制凝集(完全不凝集)的最大稀釋度為該血清的血凝抑制HI抗體效價，用以 2為底的負對數(shù)(-log2)表示，即Xlog2.

2.6 小鼠腹腔巨噬細胞吞噬能力的測定

小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗參照付紹玲[16]的實驗方法，計錄100個巨噬細胞中所吞噬雞紅細胞的數(shù)目和有吞噬雞紅細胞的巨噬細胞數(shù)目，按下列公式計算吞噬百分比和吞噬指數(shù):

2.7 統(tǒng)計學處理

3 結(jié)果與分析

3.1 綠蘿花對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響

表1表明:綠蘿花低、中、高劑量組與空白組及黃芪多糖組的吞噬百分比差異不顯著(P＞0.05).在吞噬指數(shù)上，與空白組相比，低劑量組、黃芪多糖組有極顯著差異(P＜0.01)，中、高劑量組差異不顯著(P＞0.05)；與黃芪多糖組相比，低、中劑量組無顯著差異(P＞0.05)，高劑量組差異顯著(P＜0.05).結(jié)果表明:低劑量綠蘿花組可以增強小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬指數(shù)，且增強作用極顯著.

3.2 綠蘿花對小鼠血清抗體滴度的影響

表2表明:在ND抗體效價上，與空白組相比，低劑量組、黃芪多糖組在各時間點均有極顯著(P＜0.01)提高，中劑量組在給藥后第7d有顯著(P＜0.0 5)提高，第14和21d都有極顯著(P＜0.01)提高，高劑量組僅在給藥后第7d有顯著(P＜0.05)提高；與黃芪多糖組相比，低、中劑量組在各時間點上異差不顯著了(P＞0.0 5)，高劑量組在給后第21d有極顯著(P＜0.01)降低.結(jié)果表明:低、中劑量綠蘿花組具有促進小鼠血清ND抗體產(chǎn)生的作用.

表1 綠蘿花水提物對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬能力的影響(±Se，n﹦12)Table1 Effects of Scindapsus aureus extract on macrophage phagocytosis in mice(±Se，n﹦12)

表1 綠蘿花水提物對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬能力的影響(±Se，n﹦12)Table1 Effects of Scindapsus aureus extract on macrophage phagocytosis in mice(±Se，n﹦12)

注:同列右肩有相同字母表示無顯著差異(P＞0.05)，字母相同但大小寫不同表示有顯著差異(P＜0.05)，字母和大小寫都不同表示有極顯著差異(P＜0.01).

組 別 吞噬百分比(%) 吞噬指數(shù)空白組 42.50±8.85ab 0.59±0.25ab黃芪多糖組 43.42±6.00ab 0.92±0.23CD低劑量組 45.92±6.30ac 1.12±0.33D中劑量組 39.58±6.24bC 0.77±0.25aBC高劑量組 42.33±8.62ab 0.51±0.21b

表2 綠蘿花水提物對小鼠血清新城疫體效價的影響(±Se，n﹦12，log2)Table2 Effects of Scindapsusaureus extract on serum antibody inm ice(±Se，n＝12，log2)

表2 綠蘿花水提物對小鼠血清新城疫體效價的影響(±Se，n﹦12，log2)Table2 Effects of Scindapsusaureus extract on serum antibody inm ice(±Se，n＝12，log2)

注:同表1的注.

組 別 給藥結(jié)束后的時間(d) 7 14 21空白組 6.00±1.21a 5.67±0.89a 5.42±0.90a黃芪多糖組 7.58±1.00BC 6.92±0.79bC 6.75±0.45B低劑量組 8.00±0.85C 7.08±0.79C 7.00±0.60B中劑量組 7.17±0.94Bc 6.75±1.06bC 6.58±0.51B高劑量組 6.92±0.79AB 6.33±0.49abc 5.67±0.78a

3.3 綠蘿花對小鼠外周血淋巴細胞增殖的影響

表3表明:在淋巴細胞刺激指數(shù)上，與空白組相比，黃芪多糖組在各時間點都有極顯著(P＜0.01)提高，低劑量組在給藥后第7d有極顯著(P＜0.01)提高，第14d有顯著(P＜0.05)提高；中劑量在給藥后第14d有顯著(P＜0.05)提高；高劑量組各時間點異差不顯著(P＞0.05)；與黃芪多糖組相比，低、中劑量在各時間點異差不顯著(P＞0.05)，高劑量在給藥后第14d極顯著(P＜0.01)低于黃芪多糖組和低、中劑量組.結(jié)果表明:低、中劑量綠蘿花組具有促進小鼠外周血淋巴細胞增殖的作用，作用顯著優(yōu)于高劑量綠蘿花并與黃芪多糖相當.

表3 綠蘿花水提物對小鼠外周血淋巴細胞的刺激指數(shù)的影響(±Se，n﹦12)Table3 Effects of Scindapsus aureus extract on peripheral blood lymphocyte proliferation inmice(±Se，n＝12)

表3 綠蘿花水提物對小鼠外周血淋巴細胞的刺激指數(shù)的影響(±Se，n﹦12)Table3 Effects of Scindapsus aureus extract on peripheral blood lymphocyte proliferation inmice(±Se，n＝12)

注:同表1的注.

4 討論與結(jié)論

在病毒侵襲動物機體時，非特異性免疫是機體的第一道屏障.在免疫應答中，巨噬細胞是動物體內(nèi)重要的免疫調(diào)節(jié)和效應細胞，可識別、吞噬和消除病原微生物及機體衰老細胞，具有分泌特定細胞因子參與機體炎癥反應等功能，所以其吞噬異物的能力，從一定程度上反映機體的非特異性免疫水平.巨噬細胞也是重要的抗原呈遞細胞，外源性抗原物質(zhì)經(jīng)過胞內(nèi)酶的降解處理形成許多具有抗原決定簇的抗原肽并與MHCⅡ類分子結(jié)合形成抗原肽-MHCⅡ類分子復合物引起機體免疫應答反應.本研究向小鼠腹腔內(nèi)注射淀粉，可以引起非感染性的炎性滲出，從而使巨噬細胞大量在腹腔中出現(xiàn)，此時再向腹腔內(nèi)注射較大異物，則可被巨噬細胞吞噬.吞噬百分率主要反映機體非特異免疫功能的情況，吞噬指數(shù)則反映巨噬細胞吞噬能力的大小.實驗結(jié)果表明:在生理情況下雖然綠蘿花對小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬百分率沒有明顯的促進作用，但低劑量綠蘿花能夠增強小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬指數(shù)，其作用極顯著(P＜0.01)優(yōu)于空白組，與黃芪多糖無顯著差異.說明小劑量綠蘿花對機體非特異性免疫功能有促進作用，中、高劑量綠蘿花作用不明顯.

新城疫病毒能夠凝集雞紅細胞，但相應的特異性抗體可以抑制此過程，即血球凝集抑制(hemagglutination inhibition，HI)，因此利用已知病毒能夠檢測出被檢血清中的相應抗體，并可以檢測出滴定抗體的含量.B淋巴細胞通過分泌抗體介導體液免疫，抗體水平反映了機體體液免疫應答水平.本研究結(jié)果表明:從抗體產(chǎn)生時間來看，給藥結(jié)束后12h到第7d是抗體產(chǎn)生高峰值的時間段，從抗體持續(xù)時間來看，低、中劑量綠蘿花具有作進小鼠血清ND抗體產(chǎn)生的作用(平均抗體效價log2＝7.36、log2＝6.83)，極顯著(P＜0.01)優(yōu)于空白組，并與黃芪多糖(平均抗體效價log2＝7.08)無顯著差異(P＞0.05)，表明低、中劑量綠蘿花具有提高機體體液免疫功能的作用.

T細胞是機體細胞免疫的主要細胞，其外周血中的T細胞數(shù)占淋巴細胞總數(shù)的75%左右.當在體外用某些有絲分裂因子和淋巴細胞一起培養(yǎng)時，淋巴細胞的形態(tài)及代謝可能產(chǎn)生一系列變化從而轉(zhuǎn)化為淋巴母細胞，因此反映出機體的免疫狀態(tài).ConA作為一種非特異性的有絲分裂原，可以刺激T細胞發(fā)生轉(zhuǎn)化，通過在酶聯(lián)免疫檢測儀檢測前后的吸光度可以計算出淋巴細胞增殖的刺激指數(shù)，直觀體現(xiàn)轉(zhuǎn)化率的大小，表明機體細胞免疫功效狀態(tài).本試驗研究結(jié)果，與空白組相比，黃芪多糖在各個實驗時間點都有極顯著(P＜0.01)提高淋巴細胞刺激指數(shù)；低劑量綠蘿花在連續(xù)給藥7d后第7d有顯著(P＜0.05)提高，第14d有極顯著(P＜0.01)提高；中劑量綠蘿花在給藥后第14d有顯著(P＜0.05)提高，低、中劑量綠蘿花在各時間點的淋巴細胞刺激指數(shù)平均值與黃芪多糖相比較，異差不顯著(P＞0.05).結(jié)果表明:低、中劑量綠蘿花具有提高機體細胞免疫功能的作用.

根據(jù)《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》[17]對增強免疫力功能判定標準:在體液免疫功能(包括血清溶血素測定實驗或抗體生成細胞檢測實驗)、細胞免疫功能(包括遲發(fā)型變態(tài)反應實驗或小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗)、單核-巨噬細胞功能(包括自然殺傷細胞活性測定實驗或小鼠碳廊清試驗或小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞試驗)三個方面的實驗中，其結(jié)果判定如下:

一是具有免疫調(diào)節(jié)作用:在體液免疫功能、細胞免疫功能、單核-巨噬細胞功能及NK細胞功能檢測中，如其中有兩個以上(含兩個)功能檢測結(jié)果為陽性，可判定該受試物具有免疫調(diào)節(jié)作用；二是具有免疫增強效應:在一組試驗中，受試物對免疫系統(tǒng)某一方面的試驗具有增強作用而對其他方面的試驗無抑制作用，可以判定該受試物具有免疫增強效應；三是具有免疫抑制效應:在一組試驗中，受試物對免疫系統(tǒng)某一方面的試驗具有抑制作用而對其他方面的試驗無增強作用，可以判定該受試物具有免疫抑制效應.

綜合本研究的實驗結(jié)果和相關(guān)規(guī)定:低(以生藥計算，口服1.08g/次/d，連續(xù)7d)、中劑量綠蘿花(以生藥計算，口服2.16g/次/d，連續(xù)7d)對小鼠免疫功能具有增強作用.

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(責任編輯:李建忠，付強，張陽，羅敏；英文編輯:周序林，鄭玉才)

Effects of aqueous extract of Scindapsus aureus on imm une function ofm ice

YANG Rong，LIU Qun，KANG Lian-lian，WANG Sai，HAN Jin-tan

(School of Life Science and Technology，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041，P.R.C.)

This paper investigated the immune function of scindapsusaureus inmice to provide a scientific basis for rational drug use and further development，and used Scindapsusaureus decoction ofdry extractobtained from L9(34)orthogonal experimental design.N2H mice were used as research object，ConA-induced lymphocyte transformation test(CCK-8 asssay)，hemagglutination and hemagglutination inhibition test in conjunction withmacrophage phagocytosis testwere employed，and(SI)stimulation index，(HI)antibody titer，phagocytic percentage and phagocytic index were the targets of detection to investigate the effects of different doses of scindapsus aureus on immune function.The experimental resultswere that low dose of scindapsusaureus group could enhancemice phagocytic index of peritonealmacrophage，whose enhanced rolewas significantly better thanmedium doses of scindapsusaureus and control groups.，Low andmedium doses of scindapsusaureus group promoted ND antibody production in mice serum，with effectsmarkedly better than the control group，and low and medium doses of scindapsus aureus groups could promote the proliferation of the lymphocyte，and the effect obviously preceded the control group.The results showed that the lowdose(1.08g/times/d，7d)and medium dose of scindapsusaureus group(2.16g/times/d，7d)could enhance the immune function inm ice.

scindapsus aureus；lymphocyte transformation test；hemagglutination and hemagglutination inhibition test；macrophage phagocytosis tes

R285；R29

A

2095-4271(2015)03-0305-05

10.11920/xnmdzk.2015.03.008

2015-03-22

劉群(1965-)，男，漢族，四川資中人，副教授，博士；Email:liuqun2567＠163.com

國家“十二五”科技支撐計劃項目(2011BAD34B02-4)；中央高校基本科研業(yè)務費科研建設平臺(11NPT03)