南星梅，顧健

(西南民族大學(xué)民族醫(yī)藥研究院，四川 成都 610041)

藏藥五味沙棘口服液對(duì)實(shí)驗(yàn)性慢性支氣管炎大鼠模型的防治作用研究

南星梅，顧健

(西南民族大學(xué)民族醫(yī)藥研究院，四川 成都 610041)

為觀察五味沙棘口服液對(duì)實(shí)驗(yàn)性慢性支氣管炎動(dòng)物模型的防治作用，初步探討其作用機(jī)制，采用改良煙熏法復(fù)制大鼠慢性支氣管炎模型，分為7組，按設(shè)計(jì)劑量分別灌胃給藥，連續(xù)21d，末次給藥后第2d取樣，測(cè)定各組大鼠血清、肺組織及支氣管肺泡灌洗液(BALF)中內(nèi)皮素(ET-1)、一氧化氮(NO)腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細(xì)胞介素(IL-8)、丙二醛(MDA)的含量.取部分肺組織進(jìn)行病理學(xué)觀察.結(jié)果顯示模型組大鼠血清、肺組織及BALF中TNF-α、IL-8、ET-1、MDA含量均較正常組明顯升高(P＜0.01)，NO含量則明顯低于正常對(duì)照組(P＜0.01).治療組(除五味沙棘口服液低劑量組)大鼠血清、肺組織及BALF中TNF-α、IL-8、ET-1、MDA含量較模型組明顯降低(P＜0.01或P＜0.05)，NO含量則明顯高于模型組(P＜0.01或P＜0.05)，改善肺組織病理?yè)p傷.藏藥五味沙棘口服液在一定程度上可治療慢性支氣管炎，且對(duì)肺組織具有一定的保護(hù)性.其作用機(jī)制可能與它增強(qiáng)肺組織自由基清除能力、改善機(jī)體功能狀態(tài)、抑制炎性細(xì)胞因子的釋放有關(guān).

五味沙棘口服液；慢性支氣管炎；TNF-α；IL-8；ET-1；MDA

慢性支氣管炎(下文中統(tǒng)稱為:“慢支”)是臨床常見病、多發(fā)病.嚴(yán)重危害患者身心健康，當(dāng)今五味沙棘散作為對(duì)慢支具有明顯藥效的傳統(tǒng)藏藥，具有非常廣泛的應(yīng)用.

對(duì)其進(jìn)行研究和開發(fā)為一種有效的防治慢支藥物新劑型是具有一定社會(huì)效益的.

現(xiàn)代研究中較少見對(duì)五味沙棘散的機(jī)型改革.本實(shí)驗(yàn)將輔以現(xiàn)代研究方法對(duì)傳統(tǒng)藏藥經(jīng)典方防治慢支進(jìn)行研究.觀察五味沙棘口服液對(duì)以煙熏法復(fù)制的慢支癥模型的SD大鼠中血清、肺組織勻漿及支氣管肺泡灌洗液(BALF)中ET-1、NO、TNF-α、IL-8、MDA的影響，觀察組織病理學(xué)，探索其對(duì)治療慢性支氣管炎可能的作用機(jī)制.

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)SD大鼠42只，體重220±20 g，購(gòu)于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心.許可證號(hào):SCXK(川2013-24).

1.2 藥物

五味沙棘口服液由沙棘36 g、廣木香30 g、甘草18 g、梔子12 g、白葡萄干24 g，采用水提醇沉法，制成口服液(實(shí)驗(yàn)室自制).川貝枇杷糖漿，江西遠(yuǎn)東藥業(yè)有限公司，批號(hào)20131105；五味沙棘散，內(nèi)蒙古蒙藥股份有限公司，批號(hào)130951，以上生藥材藥物廣木香、白葡萄干、梔子、甘草購(gòu)自成都荷花池中藥材市場(chǎng)，沙棘購(gòu)自內(nèi)蒙古，經(jīng)西南民族大學(xué)顧健教授鑒定，所有以上藥材及飲片經(jīng)檢驗(yàn)均符合《中國(guó)藥典》2010版的規(guī)定.

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 大鼠慢支模型的復(fù)制

參照《醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法》，SD大鼠在實(shí)驗(yàn)室室溫ll℃-l7℃的環(huán)境中飼養(yǎng)一周后，除正常對(duì)照組的6只大鼠于正常的無煙環(huán)境中飼養(yǎng)外，將其余36只需要造模的大鼠置于特制煙室中，點(diǎn)燃用刨花、鋸末、煙葉各50g制成的煙條進(jìn)行煙熏，每天2次，每次30 min，每次間隔4h.持續(xù)30d.造模結(jié)束后，大鼠的氣道呈現(xiàn)典型組織病理學(xué)改變，包括明顯支氣管黏膜上皮纖毛的倒?fàn)?，上皮脫落或形成潰瘍、管腔分泌物增多、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、環(huán)狀細(xì)胞增生、管壁增厚.[2]其組織病理學(xué)改變與文獻(xiàn)報(bào)道相近，表明慢支模型復(fù)制成功.

2.2 實(shí)驗(yàn)分組

將造模組大鼠36只在模型復(fù)制成功以后，隨機(jī)進(jìn)行分組:模型組、五味沙棘口服液高、中、低劑量組、川貝枇杷糖漿對(duì)照組、五味沙棘散組.及不加處理的空白組，每組6只.

2.3 給藥

于造模結(jié)束后第2 d起，用生理鹽水10mL/kg對(duì)正常組和模型組進(jìn)行灌胃；五味沙棘口服液高劑量組(1.8 g/kg)、中劑量組(1.35 g/kg)、低劑量組(0.9 g/ kg)每日灌胃給藥治療；川貝對(duì)照組，每日用藥劑量為0.9 g/kg；購(gòu)買五味沙棘散組，每日用藥劑量1.8 g/ kg.以上7組均每日1次灌胃，持續(xù)灌胃21 d.

2.4 樣本制備

灌藥3 w后的第2 d，采用腹主動(dòng)脈取血，血樣于離心機(jī)中以4000 r/min離心5 min并分離血清.

將新分離出的約0.5 g左右的肺組織用冰生理鹽水沖洗去除表面血漬后，濾紙吸濕，放入手動(dòng)勻漿器加冰生理鹽水后研磨，制成10%的勻漿.立即于低溫離心機(jī)中以6000 r/min下離心5min，并吸取上清液.

取右側(cè)肺組織先用生理鹽水洗去表面血漬，用細(xì)線固定灌胃針頭于氣管處，用針管吸取4℃生理鹽水4 mL，反復(fù)灌洗4次，回收的灌洗液量＞90%，立即于低溫離心機(jī)中以1500 r/min下離心5 min，吸取上清液.

所有以上制備的樣本，都在制樣結(jié)束后立刻測(cè)定蛋白含量(雙縮脲法)，余液-20℃凍存待檢.按試劑盒測(cè)定說明書分別測(cè)定三種樣本中TNF-α、IL-8、ET-1、MDA、NO五項(xiàng)指標(biāo).

取部分左肺組織用10%甲醛溶液固定，HE染色，光鏡下觀察病理形態(tài)學(xué).

2.5 指標(biāo)檢測(cè)與統(tǒng)計(jì)方法

采用酶聯(lián)免疫法測(cè)定:TNF-α、IL-8、ET-1，MDA、NO嚴(yán)格按試劑盒說明書檢測(cè).實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用方差分析和q檢驗(yàn).應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件統(tǒng)計(jì)分析.

3 結(jié)果與分析

3.1 各組大鼠血清及肺組織中TNF-α、IL-8、ET-1、MDA、NO含量變化

采用改良煙熏法復(fù)制的慢性支氣管炎大鼠血清、肺組織及BALF中的TNF-α、IL-8、ET-1、MDA含量均較正常對(duì)照組明顯升高(P＜0.01)，NO含量則明顯低于正常對(duì)照組(P＜0.01).治療組(除五味沙棘口服液低劑量組)大鼠血清、肺組織及BALF中TNF-α、IL-8、ET-1、MDA含量較模型組明顯降低(P＜0.01或P＜0.05)，NO含量則明顯高于模型組(P＜0.01或P＜0.05)，改善肺組織病理?yè)p傷.結(jié)果見表1-表5.

表1 五味沙棘口服液對(duì)大鼠慢性支氣管炎NO含量的影響(±s，n＝6)Table1 The Impact of Wuwei Shaji oral liquids on the NO content in rat chronic bronchitis

表1 五味沙棘口服液對(duì)大鼠慢性支氣管炎NO含量的影響(±s，n＝6)Table1 The Impact of Wuwei Shaji oral liquids on the NO content in rat chronic bronchitis

注:與模型組比較，1)P＜0.05，2)P＜0.01；與空白組比較，3)P＜0.05，4)P＜0.01

組別 劑量/g·kg-1 組織/pg·mL-1 血清/pg·mL-1 BALF/pg·m L-1空白組 — 10.03±0.28 489.85±19.17 94.05±13.46模型組 — 6.72±0.914) 351.38±16.584) 66.87±11.624)中藥陽(yáng)性組 0.9 8.59±0.742) 408.63±38.241) 83.53±12.38五味沙棘散組 0.9 7.97±0.59 428.36±18.752) 84.53±10.582)五味沙棘口服液高 1.8 7.77±0.791) 446.22±44.841) 88.15±22.332)中1.35 7.99±0.69 438.36±33.75 79.73±12.361)低0.9 7.21±1.01 422.20±36.20 74.85±17.24

表2 五味沙棘口服液對(duì)大鼠慢性支氣管炎MDA含量的影響(±s，n＝6)Table2 The Impact of Wuwei Shaji oral liquids on the MDA content in rat chronic bronchitis

表2 五味沙棘口服液對(duì)大鼠慢性支氣管炎MDA含量的影響(±s，n＝6)Table2 The Impact of Wuwei Shaji oral liquids on the MDA content in rat chronic bronchitis

注:與模型組比較，1)P＜0.05，2)P＜0.01；與空白組比較，3)P＜0.05，4)P＜0.01

組別 劑量/g·kg-1 組織/nmol·mL-1 血清/nmol·m L-1 BALF/nmol·m L-1空白組 — 3.33±0.48 329.85±13.46 5.42±1.94模型組 — 4.68±0.614) 391.38±14.884) 7.68±1.994)中藥陽(yáng)性組 0.9 4.19±0.872) 348.63±28.541) 5.64±1.011)五味沙棘散組 0.9 3.78±0.421) 372.63±15.441) 5.84±1.231)五味沙棘口服液高 1.8 3.58±0.591) 366.22±46.841) 5.97±1.281)中1.35 3.87±0.63 378.36±23.851) 5.77±1.831)低0.9 3.91±1.06 382.20±15.73 6.62±1.35

表3 五味沙棘口服液對(duì)大鼠慢性支氣管炎ET-1含量的影響(±s，n＝6)Table3 The Impact of Wuwei Shaji oral liquids on the ET-1 content in rat chronic bronchitis

表3 五味沙棘口服液對(duì)大鼠慢性支氣管炎ET-1含量的影響(±s，n＝6)Table3 The Impact of Wuwei Shaji oral liquids on the ET-1 content in rat chronic bronchitis

注:與模型組比較，1)P＜0.05，2)P＜0.01；與空白組比較，3)P＜0.05，4)P＜0.01

組別 劑量/g·kg-1 組織/pg·mL-1 血清/pg·mL-1 BALF pg·mL-1空白組 — 7.02±0.41 122.35±10.28 3.44±1.64模型組 — 13.24±2.344) 199.64±12.534) 8.45±1.244)中藥陽(yáng)性組 0.9 10.34±1.47 157.63±22.371) 5.46±1.211)五味沙棘散組 1.8 6.73±1.842) 172.24±17.841) 5.26±1.361)五味沙棘口服液高 1.8 5.48±1.562) 156.22±31.841) 5.15±1.411)中1.35 7.37±1.631) 169.92±21.841) 5.97±1.471)低0.9 8.68±2.05 182.20±13.63 6.12±1.26

表4 五味沙棘口服液對(duì)大鼠慢性支氣管炎IL-8含量的影響(±s，n＝6)Table 4 The Impact of Wuwei Shaji oral liquids on the IL-8 content in rat chronic bronchitis

表4 五味沙棘口服液對(duì)大鼠慢性支氣管炎IL-8含量的影響(±s，n＝6)Table 4 The Impact of Wuwei Shaji oral liquids on the IL-8 content in rat chronic bronchitis

注:與模型組比較，1)P＜0.05，2)P＜0.01；與空白組比較，3)P＜0.05，4)P＜0.01

組別 劑量/g·kg-1 組織/pg·mL-1 血清/pg·mL-1 BALF pg·mL-1空白組 — 326.69±26.47 1234.64±48.79 440.46±38.34模型組 — 683.54±54.644) 3584.33±39.574) 807.45±32.754)中藥陽(yáng)性組 0.9 434.57±25.462) 1566.34±46.471) 530.74±42.351)五味沙棘散組 1.8 436.34±31.361) 2587.27±46.641) 530.36±46.861)五味沙棘口服液高 1.8 389.26±24.781) 1866.86±56.891) 486.56±57.341)中1.35 437.64±15.46 2579.47±35.681) 480.99±45.351)低0.9 543.68±27.89 3478.87±46.97 669.37±54.34

表5 五味沙棘口服液對(duì)大鼠慢性支氣管炎TNF-α含量的影響(±s，n＝6)Table5 The Impact of Wuwei Shaji oral liquids on the TNF-αcontent in rat chronic bronchitis

表5 五味沙棘口服液對(duì)大鼠慢性支氣管炎TNF-α含量的影響(±s，n＝6)Table5 The Impact of Wuwei Shaji oral liquids on the TNF-αcontent in rat chronic bronchitis

注:與模型組比較，1)P＜0.05，2)P＜0.01；與空白組比較，3)P＜0.05，4)P＜0.01

組別 劑量/g·kg-1 組織/pg·m L-1 血清/pg·mL-1 BALF pg·mL-1空白組 — 20.69±3.64 329.85±58.45 40.47±3.99模型組 — 45.62±4.624) 3835.36±79.564) 80.25±3.574)中藥陽(yáng)性組 0.9 34.30±5.372) 1686.34±48.961) 50.35±4.471)五味沙棘散組 1.8 33.28±3.751) 2347.63±78.451) 53.57±4.251)五味沙棘口服液高 1.8 27.94±4.291) 1746.86±96.451) 46.48±4.171)中1.35 37.59±5.92 2399.47±73.261) 49.59±4.681)低0.9 42.91±4.07 3345.87±97.34 69.62±5.31

3.2 病理形態(tài)學(xué)改變

表6 肺組織病理改變?cè)u(píng)分Table6 Lung histopathology score

光鏡下觀察:空白對(duì)照組:支氣管粘膜上皮細(xì)胞完整，細(xì)胞排列整齊，支氣管管壁及肺泡無明顯的病理學(xué)改變(如圖1A).模型組:支氣管管壁大量纖維組織增生，且明顯可見其管壁有明顯的增厚，支氣管粘膜上皮細(xì)胞大量脫落，且有杯裝的細(xì)胞增生，支氣管周圍可見大量以淋巴細(xì)胞為主的慢性炎細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡上皮細(xì)胞有部分壞死脫落，肺泡間隔變大，小靜脈有淤血的現(xiàn)象(如圖1B).川貝對(duì)照組:支氣管粘膜上皮細(xì)胞較為完整，支氣管周圍也沒有明顯的炎細(xì)胞浸潤(rùn)，肺間隔沒有充血水腫，僅見支氣管管壁增厚和纖維組織的增生(如圖1C).五味沙棘散組:支氣管管壁纖維組織有增生，且管壁增厚，支氣管周圍可見大量以淋巴細(xì)胞為主的慢性炎細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡間隔有一定程度的充血水腫，小靜脈有淤血的現(xiàn)象(如圖1D).五味沙棘口服液低劑量組:支氣管粘膜上皮細(xì)胞有損傷和脫落，支氣管管壁纖維組織有明顯的增生和管壁的增厚，支氣管周圍炎性細(xì)胞浸潤(rùn).肺間隔增寬(如圖1E).五味沙棘口服液中劑量組:支氣管粘膜上皮細(xì)胞較為完整，但伴可以看出支氣管管壁纖維組織有一定的增生和管壁的增厚現(xiàn)象，同時(shí)伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn).肺間隔增大(如圖1F).五味沙棘口服液高劑量組:支氣管粘膜上皮細(xì)胞完整，未見有明顯的細(xì)胞水腫，支氣管管壁也未見明顯的增厚，僅有少量的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)的現(xiàn)象(如圖1G).

圖1 肺組織病理切片圖Fig.1 Lung tissue pathological sectionsA:空白正常(Blank group)；B:模型(Model group)；C:川貝對(duì)照組(Chuanbei pipa syrup group)；D:五味沙棘散(Wuwei Shaji San group)；E:低劑量組(Low-dose group)；F:中劑量組(Middle dose group)；G:高劑量組(High-dose group)；

4 討論

采用改良煙熏法復(fù)制的慢性支氣管炎模型構(gòu)建成功；本實(shí)驗(yàn)中模型組大鼠血清、肺組織及BALF中TNF-α、IL-8、ET-1、MDA含量均較正常組明顯升高，NO含量則明顯低于正常對(duì)照組，經(jīng)過給藥，發(fā)現(xiàn)五味沙棘口服液高、中劑量可以明顯降低MDA含量，提示①五味沙棘口服液具有抗脂質(zhì)過氧化作用，并通過該作用減輕脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物對(duì)肺組織和支氣管的損傷.②ET-l含量低于模型組，說明經(jīng)治療后ET-1的釋放受到抑制，從而減輕氣道的炎癥反應(yīng)和組織損傷.③NO含量高于模型組，顯示出治療各組藥物均能提高NO的含量，從而恢復(fù)肺部血管、支氣管平滑肌正常的舒張狀態(tài)，控制肺部慢性炎癥，改善機(jī)體功能狀態(tài).④炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-8的合成與釋放的增多對(duì)慢性支氣管炎的形成有重要影響，經(jīng)治療給藥后，TNF-α、IL-8含量較模型組具有明顯的降低，這可能證明五味沙棘口服液抑制了巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的趨化和激活，減少了炎癥物質(zhì)的釋放，從而減輕和控制炎癥反應(yīng)有關(guān)，防止其對(duì)機(jī)體組織的進(jìn)一步損害.同時(shí)，有病理切片可知，經(jīng)治療用藥，五味沙棘口服液高劑量組較低、中劑量組與川貝對(duì)照組、五味沙棘散組能顯著改善慢支大鼠支氣管、肺組織損傷程度，表現(xiàn)為:用藥后氣管粘膜上皮細(xì)胞完整，未見有明顯的細(xì)胞水腫，支氣管管壁也未見明顯的增厚，僅有少量的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)的現(xiàn)象.上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，藏藥五味沙棘口服液對(duì)慢性支氣管炎及肺組織具有一定的保護(hù)作用，該作用可能與藥物抗肺組織自由基損傷，增強(qiáng)機(jī)體自由基清除能力，抑制炎性細(xì)胞因子釋放等多途徑共同作用相關(guān).

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(責(zé)任編輯:李建忠，付強(qiáng)，張陽(yáng)，羅敏；英文編輯:周序林，鄭玉才)

Preventive and curative effects of Wuwei Shaji oral liquid on chronic bronchitis

NAN Xing-mei，GU Jian

(Institute of National Medicine，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041，P.R.C.)

To observe themechanism of Wuwei Shaji oral liquid on treating experimental chronic bronchitis，this paper duplicated the animalmodel of chronic bronchitis using refined smoking-fumigated method.The rats were allocated to 7 groups and administrated with designed agents and dose by gavage for21 days.On the second day after the last dose，sampleswere collected formeasuring the ET-1，NO，TNF-α，IL-8 and MDA contents in the serum，lung homogenate and BALF of each group and observing histopathology changes of lung tissue.The ET-1，TNF-α，IL-8 and MDA levels in the serum，lung tissue and BALF inmodel group are significantly higher than those in normal group(P＜0.01)，while the NO content is significantly lower than that in normal group(P＜0.01).The TNF-α，IL-8，ET-1，MDA contents in the serum，lung tissue and BALF in treatmentgroups(except for low dose Wuwei Shaji oral liquid group)were significantly reduced(P＜0.05 or P＜0.01)，the NO content is significantly increased，compared with the normal group(P＜0.05 or P＜0.01)，and the injured pulmonary tissuewas improved.To some extent，Wuwei Shaji oral liquid could treat chronic bronchitis and protect pulmonary tissue，and themechanism may be related to the enhancement of radical scavenging capacity，improvement on functional status of body，and inhibition of inflammatory cytokine release.

Wuwei Shaji oral liquid；chronic bronchitis；TNF-α；IL-8；ET-1；MDA

R285；R29

A

2095-4271(2015)03-0299-06

10.11920/xnmdzk.2015.03.007

2014-12-02

顧健(1967-)，男，漢族，浙江武義人，教授，博士研究生導(dǎo)師，研究方向:中藥及民族藥物研究開發(fā)；E-mail:gujian_3＠163.com.

四川省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2013SZ0124)；研究生“創(chuàng)新型科研項(xiàng)目”(CX2014SZ52)