時(shí)毅敏魏川江唐世潔唐世平戴黎萌

MARVELD1在腦膠質(zhì)瘤中表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究*

時(shí)毅敏①魏川江②唐世潔②唐世平②戴黎萌③

目的：探討人腦膠質(zhì)瘤組織中MARVELD1 的表達(dá)。方法：RT-PCR和Western blot技術(shù)檢測(cè)33例腦膠質(zhì)瘤組織蛋白和mRNA的表達(dá)，并以11例正常腦組織為對(duì)照。結(jié)果：相較于正常腦組織，Ⅰ級(jí)、Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)、Ⅳ級(jí)腦膠質(zhì)瘤組織中MARVELD1蛋白和mRNA的表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），Ⅲ級(jí)、Ⅳ級(jí)腦膠質(zhì)瘤組織中MARVELD1蛋白和mRNA的表達(dá)水平低于Ⅰ～Ⅱ級(jí)腦膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織（P＜0.05）。結(jié)論：MARVELD1對(duì)腦膠質(zhì)瘤惡性程度判斷有一定的指導(dǎo)意義，并為腦膠質(zhì)瘤臨床治療提供了新的靶標(biāo)。

腦膠質(zhì)瘤； MARVELD1； 實(shí)驗(yàn)研究

腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤是來源于神經(jīng)上皮的顱內(nèi)最常見的原發(fā)性腫瘤，占顱內(nèi)腫瘤的40％～50％，膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者的治療主要以積極的手術(shù)、放、化療等治療措施為主，但該腫瘤多呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，手術(shù)不易全切[1-2]?；颊哳A(yù)后仍較差，WHO分級(jí)Ⅲ級(jí)的膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者平均生存期約3～5年，多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者平均生存期尚不足1年[3-4]，因此尋找新的腦膠質(zhì)瘤治療靶點(diǎn)成為當(dāng)前亟待解決的難題。MARVELD1基因是定位于人類10號(hào)染色體長(zhǎng)臂10q24.2的一個(gè)新的候選抑癌基因，該基因在多種正常組織中表達(dá)，而在乳腺癌、肺癌、腎癌等多種癌癥中 MARVELD1基因的表達(dá)呈明顯下調(diào)[5-6]。因此本研究通過對(duì)不同病理級(jí)別腦膠質(zhì)瘤組織中MARVELD1的表達(dá)，以期從MARVELD1在其發(fā)病機(jī)制中的調(diào)控作用，為腦膠質(zhì)瘤的靶向治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2013年1月-2014年4月入住本院神經(jīng)外科的符合腦膠質(zhì)瘤的患者33例?；颊呔鶠槌醢l(fā)，術(shù)前未接受放、化療等治療，其中男18例，女15例，年齡7～70歲，平均（40.2±19.3）歲；星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤20例，少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤3例，室管膜細(xì)胞瘤5例，髓母細(xì)胞瘤3例，多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤1例，膠質(zhì)肉瘤1例；按照2007年WHO神經(jīng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理分級(jí)，其中I～I(xiàn)I級(jí)15例，III級(jí)10例，IV級(jí)8例。另取11例來自同期收治的腦外傷或腦出血患者的正常腦組織標(biāo)本作為對(duì)照，患者男6例，女5例，年齡16～47歲，平均（32.3±12.3）歲。兩組患者在性別、年齡方面比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 主要儀器與試劑 熒光定量PCR儀及分析軟MXPro 4.01（Stratagene公司）；凝膠成像系統(tǒng)（柯達(dá)公司）。一抗兔抗人MARVELD1單克隆抗體（Abcam）；兔抗羊免疫熒光IgG二抗（美國(guó)Santa Cruz公司），TRIzol試劑盒（Gibco 公司），RT-PCR引物由Takara生物技術(shù)有限公司合成，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RTPCR）試劑盒為公司產(chǎn)品。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 標(biāo)本采集 符合納入標(biāo)準(zhǔn)的腦膠質(zhì)瘤的患者與11例健康正常者均收集手術(shù)切除的新鮮腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本，標(biāo)本均經(jīng)病理確診，離體后0.5 h內(nèi)轉(zhuǎn)至-80 ℃低溫冰箱凍存。手術(shù)切除后標(biāo)本分成兩部分，一部分用于MARVELD1 mRNA的檢測(cè)，另一部分用于MARVELD1蛋白的檢測(cè)。

1.3.2 RT-PCR檢測(cè)腦組織 MARVELD1 mRNA表達(dá) 采用TRIzol 法抽提總RNA，將 RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。取1 μL作為模板進(jìn)行 RT-PCR反應(yīng)。MARVELD1引物序列，上游：5'-GAGGAAGTAGATTGCTGCCTCTAG-3'；下游：5'-GAGAGCGGTCGGTGTGACCAGCTCTG-3'。β-actin引物序列，上游：ATGGG TCAGA AGGATTCCT ATGTG；下游：CTTCATGAGGTAG TCAGT CA GGTC。RT-PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃延伸 1 min（30 cycle）；72 ℃終延伸10 min。

1.3.3 Western Blot檢測(cè)PBMC中MARVELD1蛋白的表達(dá)水平 取適當(dāng)腦組織加入液氮快速研磨后，加入相應(yīng)體積的裂解液，放置冰上充分作用30 min后；收集裂解物入，4 ℃離心30 min，-80 ℃凍存。采用蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測(cè)MARVELD1 蛋白的變化，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜與封閉，一抗及二抗孵育。在凝膠成像儀上掃描條帶，以其和內(nèi)參β-actin灰度值的比值來反映其相對(duì)含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用 χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腦膠質(zhì)瘤組織與健康正常腦組織mRNA的提取 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，腦膠質(zhì)瘤腦組織Ⅰ～Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)、Ⅳ級(jí)與健康正常腦組織總RNA均可見清晰的18S和28S條帶，說明總RNA純度基本達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求，且樣品保存質(zhì)量較好無明顯降解；對(duì)提取的mRNA用紫外分光光度計(jì)測(cè)量A260/A280值為1.8～2.0，說明mRNA總量及質(zhì)量滿足實(shí)時(shí)定量熒光RT-PCR的要求。

2.2 腦膠質(zhì)瘤腦組織與健康正常腦組織標(biāo)本中MARVELD1mRNA水平的表達(dá)差異 為驗(yàn)證MARVELD1在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)情況，用RT-PCR檢測(cè)MARVELD1 mRNA的表達(dá)，如圖1、表1所示，相較于正常組織，MARVELD1 mRNA在腦膠質(zhì)瘤Ⅰ～Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)、Ⅳ級(jí)組織中相對(duì)表達(dá)降低，且Ⅲ級(jí)和Ⅳ級(jí)組織低于Ⅰ～Ⅱ級(jí)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表示MARVELD1 mRNA在腦膠質(zhì)瘤組織中特異表達(dá)顯著下調(diào)。本實(shí)驗(yàn)均以β-actin為內(nèi)參，應(yīng)用商品化的引物，得到的溶解曲線為單峰，結(jié)果符合要求。

圖1 各組MARVELD1 mRNA水平的表達(dá)差異注：1 正常組織，2 腦膠質(zhì)瘤Ⅰ～Ⅱ級(jí)，3 Ⅲ級(jí)，4 Ⅳ級(jí)

表1 各組MARVELD1 mRNA水平的表達(dá)差異

2.3 腦膠質(zhì)瘤腦組織與健康正常腦組織標(biāo)本中MARVELD1蛋白水平的表達(dá)差異 提取正常組織和腦膠質(zhì)瘤Ⅰ～Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)、Ⅳ級(jí)組織的蛋白，用western bloting檢測(cè)MARVELD1蛋白的表達(dá)，如圖2、表2所示，MARVELD1在腦膠質(zhì)瘤Ⅰ～Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)、Ⅳ級(jí)組織中相對(duì)表達(dá)降低，且Ⅲ級(jí)和Ⅳ級(jí)組織低于Ⅰ～Ⅱ級(jí)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表示MARVELD1 蛋白在腦膠質(zhì)瘤組織中特異表達(dá)顯著下調(diào)。

圖2 各組MARVELD1 蛋白水平的表達(dá)差異注：1 正常組織，2 腦膠質(zhì)瘤Ⅰ～Ⅱ級(jí)，3 Ⅲ級(jí)，4 Ⅳ級(jí)

3 討論

MARVELD1 是癌癥發(fā)生及轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制過程中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新的候選抑癌基因，其含有一個(gè)較為保守的膜相關(guān)結(jié)構(gòu)域MARVEL （MAL and related proteins for vesicle trafficking and membrane link，具有囊泡運(yùn)輸和膜連接功能的MAL及相關(guān)蛋白），MARVEL結(jié)構(gòu)域的蛋白參與了clathrin調(diào)節(jié)的細(xì)胞內(nèi)吞作用、細(xì)胞凋亡、突觸囊泡的融合、細(xì)胞的趨化活力、成肌細(xì)胞的融合和緊密連接等相關(guān)進(jìn)程[7-8]。MARVELD1 mRNA全長(zhǎng)3238bp，含有兩個(gè)外顯子，編碼區(qū)位于第一外顯子內(nèi)，其編碼蛋白含有173個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量約為18.9 kDa[9]。MARVELD1 蛋白定位于細(xì)胞核和線粒體中，而在細(xì)胞質(zhì)中的含量很少[10]。

表2 各組MARVELD1蛋白水平的表達(dá)差異

MARVELD1作為一個(gè)新的候選抑癌基因，在多種正常組織中表達(dá)，而且與癌旁對(duì)照相比，P. M. Alves等通過大規(guī)?；虮磉_(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)MARVELD1 在結(jié)腸癌中處于高表達(dá)狀態(tài)[11-12]。通過ONCOMINE網(wǎng)站的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)檢索發(fā)現(xiàn)MARVELD1 在男性生殖細(xì)胞腫瘤中的表達(dá)明顯高于正常的睪丸組織；在多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤以及星形細(xì)胞瘤中的表達(dá)則明顯低于正常腦組織；在前列腺腺癌中的表達(dá)也低于正常前列腺組織[13-14]。采用腫瘤表達(dá)芯片對(duì)19種不同類型的原發(fā)腫瘤樣本，系統(tǒng)分析了MARVELD1基因在多種人類原發(fā)癌中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在154對(duì)病例中有69對(duì)（45％）MARVELD1基因在腫瘤組織中出現(xiàn)了表達(dá)下調(diào)，特別是腎癌、膀胱癌、乳腺癌、肝癌，以及卵巢癌、子宮癌、女性外陰癌、宮頸癌和睪丸癌等生殖系統(tǒng)腫瘤中MARVELD1基因的表達(dá)受到明顯的抑制[15-16]。

本研究發(fā)現(xiàn)，腦膠質(zhì)瘤組織中MARVELD1蛋白和mRNA表達(dá)水平均低于正常腦組織，并且隨膠質(zhì)瘤細(xì)胞分化程度的降低（ 病理級(jí)別的升高）而逐漸下降，表明MARVELD1基因表達(dá)下調(diào)可能是腦細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的原因之一，提示MARVELD1可作為腦膠質(zhì)瘤惡性程度判斷的輔助指標(biāo)用于臨床。

綜上所述，通過檢測(cè)腦膠質(zhì)瘤組織中MARVELD1的表達(dá)，可能對(duì)腦膠質(zhì)瘤惡性程度及預(yù)后的判斷有一定的指導(dǎo)意義，并為腦膠質(zhì)瘤臨床治療提供了新的靶標(biāo)。

[1]何景揚(yáng)，林瑞藹.惡性膠質(zhì)瘤手術(shù)后放療的臨床療效及預(yù)后影響因素[J].中外醫(yī)學(xué)研究，2012，10（21）：26-27.

[2]李荔榮，趙建偉，胡昌辰，等.福莫司汀化療聯(lián)合立體定向放射治療腦膠質(zhì)瘤的臨床療效觀察[J].中外醫(yī)學(xué)研究，2013，11（23）：19.

[3]肖淳文，蔣林，曾連，等.CEACAM1在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)與血管生成關(guān)系的研究[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2011，8（3）：3-5.

[4]倪恒，竇長(zhǎng)武.生存素Survivin與腦膠質(zhì)瘤的研究進(jìn)展[J].中外醫(yī)學(xué)研究，2014，12（14）：150-153.

[5] Wang S， Li Y， Han F， et al. Identification and characterization of MARVELD1， a novel nuclear protein that is down-regulated in multiple cancers and silenced by DNA methylation[J]. Cancer Letters，2009， 282（1）： 77-86.

[6] Riazuddin S， Ahmed Z M， Fanning A S， et al. Tricellulin is a tightjunction protein necessary for hearing[J]. Genet， 2006， 79（5）：1040-1051.

[7] Clement Q J， Shareen M L， Bobby L W. Gene expression profiling of human epidermal keratinocytes in simulated microgravity and recovery cultures[J].Geno Prot Bioinfo， 2008， 6（9）： 8-28.

[8] Hirst M， Marra M A. Epigenetics and human disease[J]. Int J Biochem Cell Biol， 2009， 41（1）： 136-146.

[9] Quon H， Abdulkarim B. Adjuvant treatment of anaplastic oligodendrogliomas and oligoastrocytomas[J]. Cochrane Database Syst Rev， 2008，28（2）：CD007104.

[10] Wenwei Hu，Zhaohui Feng， Ippolito Modica， et al. Gene amplifications in well-differentiated pancreatic neuroendocrine tumors inactivate the p53 pathway[J]. Genes Cancer， 2010， 1（4）：360-368.

[11]高志安，張世羽，楊光華.腫瘤抑制基因p16研究進(jìn)展[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2003，30（1）：70-72.

[12]馬慶防，楊梅，陳劍，等.人腦膠質(zhì)瘤中MMP-9、CD133蛋白的表達(dá)及臨床意義[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2012，9（3）：8-10.

[13] Hatada I， Fukasawa M， Kimura M. Genome-wide profiling of promoter methylation in human[J]. Oncogene， 2006， 25（9）： 3059-3064.

[14]郭新，種衍軍，陳劍.人腦膠質(zhì)瘤中細(xì)胞周期蛋白D1和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)和意義[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2010，7（9）：3-5.

[15] Alves P M， Lévy N， Stevenson B J， et al. Identification of tumorassociated antigens by large scale analysis of genes expressed in human colorectal cancer[J]. Cancer Immun，2008，8（5）：11.

[16]王山.候選腫瘤抑制基因MARVELD1的表達(dá)及功能研究[D].哈爾濱：哈爾濱工業(yè)大學(xué)，2013.

Expression of MARVELD1 in Human Glioma Tissue

SHI Y i-min，WEI Chuan-jiang，TANG Shi-jie，et al.//Medical Innovation of China，2015，12（09）：037-039

Objective：To explore the relationship the expression of autophagy-related gene MARVELD1 in human glioma tissue. Method： Western blot and RT-PCR technology were used to detect the expressions of MARVELD1 protein and mRNA in 33 cases of glioma tissue and 11 cases of normal brain tissue. Result：There were significant differences in the expressions of MARVELD1 protein and mRNA among normal brain tissue grade Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ andⅣ glioma tissue（P＜0.05）. The expressions of MARVELD1 protein and mRNA in grade Ⅲ and grade Ⅳ glioma tissue were lower than those in grade Ⅰ， grade Ⅱ glioma tissue and normal brain tissue（P＜0.05）. The expression of MARVELD1 protein in grade Ⅰ and grade Ⅱ glioma tissue was lower than that in normal brain tissue（P＜0.05）. Conclusion： MARVELD1 of glioma malignancy judge has a certain significance， and provides a new target for the clinical treatment of glioma.

Glioma； MARVELD1； Experimental research

10.3969/j.issn.1674-4985.2015.09.012

2014-08-07） （本文編輯：蔡元元）

廣東省深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目（201203374）

①?gòu)V東省深圳市光明新區(qū)中心醫(yī)院 廣東 深圳 518107

②廣東省深圳市光明新區(qū)人民醫(yī)院

③廣東省深圳市人民醫(yī)院

時(shí)毅敏

First-author’s address：Shenzhen Guangming New District Central Hospital，Shenzhen 518107，China