劉碧英

(長沙衛(wèi)生職業(yè)學院 湖南長沙 410100)

生物可降解材料作為基因和藥物載體,是腫瘤靶向治療研究的熱點。本實驗室制備的四代聚酰胺-胺型枝狀聚合物型納米粒(polyamidoamine,PAMAM)具有良好的生物相容性和生物可降解性。PAMAM能夠防止其被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)清除,提高生物相容性,延長其在體內(nèi)的分布時間［1］。采用PAMAM制備包載藥物或基因的納米粒(nanoparticles,NPs)可以用于腫瘤的靶向治療［2］。葉酸受體是一種糖基化磷脂酰肌醇連接的膜糖蛋白,可以介導細胞內(nèi)吞,將葉酸攝入胞漿的一種高親和力受體,在某些腫瘤細表面高度表達,而正常組織沒有或很少表達,因而具良好的腫瘤組特異性[3-4]。葉酸分子量小,與葉酸受體具有很強的親和力,屬于機體的內(nèi)源性物質,沒有免疫原性,因此廣泛的應用于抗腫瘤藥物和納米載體靶向傳遞[5-6]。我們采用FA對PAMAM進行修飾并制備了帶FA單克隆抗體的PAMAM,作為肝癌靶向治療的藥物遞送載體。本研究通過對肝癌細胞HepG2的體外與體內(nèi)實驗,初探FA-PAMAM對肝癌的靶向效果,為肝癌的靶向遞送系統(tǒng)構建提供初步的實驗基礎。

圖1 PAMAMNPs和PAMAM-FANPs的粒徑A:PAMAMNPs;B:PAMAM-FANPs.

圖3 HepG2細胞體外攝取PAMAM-FANPs的熒光顯微鏡和激光共聚焦斷層掃描圖片

圖2 MTT法檢測PAMAMNPs和PAMAM-FANPs對HepG2細胞生存影響A:PAMAMNPs;B:PAMAM-FANPs.細胞存活率(%)

圖4 HepG2細胞攝取PAMAMNPs和PAMAM-FANPs定性、定量比較

圖5 PAMAMNPs和PAMAM-FANPs在荷HepG2瘤裸鼠體內(nèi)在4、24和48小時分布情況

1 材料和方法

1.1 材料

肝癌細胞HepG2購自中國科學院上海分院細胞庫;羅丹明B(RhodmaineB,RB)、Cy5、四甲基偶氮唑藍(MTT)購自美國Sigma公司;PluronicF68(F68)購自德國BASF公司;其他試劑購自國藥集團;BALB/c(nu/nu)雌性裸鼠購自上海市腫瘤研究所動物實驗中心;實驗儀器包括離心機(AnkeTGL-16B)、Zeta電位粒徑分析儀(ZetasizerNanoZS)、熒光顯微鏡成像系統(tǒng)(OlympusIX51)、激光共聚焦成像系統(tǒng)(OlympusFV1000)、FACSCALIBUR流式細胞儀和CRIMaestroTM活體成像系統(tǒng)等。

1.2 NPs制備與表征

稱取PAMAM0.1g、TEA0.0245g溶于90ml無水甲醇中,丁二酸酐9.1mg溶于6ml無水甲醇中,逐滴加入前一溶液里,室溫攪拌24h。旋轉蒸發(fā)甲醇,剩余物溶于水中進行透析,透析液冷凍干燥處理。稱取PAMAM-丁二酸酐12.758mg、EDC2.04mg溶于4ml水中反應3h。稱取FA9.2mg,溶于lmlDMSO中,逐滴加入到前一溶液里,攪拌過夜。樣品進行透析和冷干處理,即得PAMAM-FA納米粒。 稱取PAMAM-FA4mg,充分溶于200μL二氯甲烷,加入2mg/mLRB溶液20μL,超聲強度300W,超聲時間每次為10s,共5次,再加入2mLF68(1%)溶液,超聲強度300W,時間設為每次為10s,共7次,最后真空旋蒸除去二氯甲烷,即得RB標記的PAMAM-FANPs,以相同方法制備PAMAMNPs。取適量PAMAMNPs和PAMAM-FANPs測定其粒徑和表面電位。

1.3 HepG2細胞攝取NPs的濃度

將HepG2細胞在含10%的胎牛血清(法國Biowest公司)和1%的青霉素/鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)液(法國Biowest公司)中,置于CO2體積分數(shù)為5%的37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。取Huh7細胞鋪96孔板,每孔100μL,細胞密度為5×104/mL,進行細胞培養(yǎng)待貼壁。取制備的PAMAMNPs和PAMAM-FANPs分別加入孔中,NPs的終濃度分別為:0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1和2mg/mL,另設調(diào)零組及空白對照組。HepG2與NPs共溫育24h后,加入MTT(5mg/mL)溶液20μL,繼續(xù)培養(yǎng)4h,吸取培養(yǎng)液,加DMSO100μL溶解后,在酶標儀490nm處檢測吸光度值(A)。記錄數(shù)值,按照存活率公式［存活率=(A實驗孔-A調(diào)零孔)/(A空白對照組-A調(diào)零孔)］計算細胞的存活率,每個實驗條件設置5個復孔。

1.4 HepG2細胞攝取PAMAM-FANPs的觀察

取HepG2細胞輔在培養(yǎng)皿中,加入細胞0.5mL,細胞數(shù)5×103個,設3個復孔,進行細胞培養(yǎng)待貼壁。將培養(yǎng)液置換成含有0.2mg/mLRB標記的PAMAM-FANPs的培養(yǎng)液,共溫育3h,除去培養(yǎng)液,用PBS充分洗滌3次,然后加入4%多聚甲醛固定30min,再用PBS洗滌3次。用激光共聚焦斷層掃描技術檢測Huh7細胞內(nèi)RB標記的PAMAM-FANPs的分布情況(RB的激發(fā)光波長為540nm,發(fā)射光波長為625nm)。

1.5 HepG2細胞對NPs攝取的定量分析

取HepG2細胞鋪24孔板和6孔板,細胞數(shù)分別為5×103和1×105個,各設3復孔,進行細胞培養(yǎng)待貼壁。24孔板與6孔板中分別用含有0.2mg/mLRB標記的PAMAMNPs或PAMAM-FANPs培養(yǎng)液置換原培養(yǎng)液,共溫育2h,然后PBS洗滌3次,24孔板用熒光顯微鏡觀察,定性比較HepG2細胞對PAMAMNPs與PAMAM-FANPs攝取的差異。6孔板細胞洗滌3次后加入1mL0.25%的胰酶消化,2000r/min離心3min,去上清液,加入200μLPBS混懸細胞,用流式細胞計數(shù)儀定量檢測HepG2細胞對PAMAMNPs和PAMAM-FANPs的攝取情況。

1.6 NPs在荷HepG2瘤裸鼠的體內(nèi)分布研究

用Cy5分別標記PAMAMNPs和PAMAM-FANPs,取荷HepG2皮下瘤的裸鼠18只,隨機分成PAMAMNPs和PAMAM-FANPs組,每組9只裸鼠,尾靜脈注射NPs0.2mL。分別在尾靜脈注射后4、24和48h后處死裸鼠,取其心、肝、脾、肺、腎和腫瘤組織,于活體成像儀上觀察Cy5標記的PAMAMNPs和PAMAM-FANPs的體內(nèi)分布情況。Cy5的激發(fā)波長為649nm,發(fā)射波長為666nm。

1.7 統(tǒng)計學分析

實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示,組間以t檢驗比較。應用SPSS18.0軟件包進行相關統(tǒng)計學處理,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 NPs粒徑和電位分布

采用旋轉蒸發(fā)法制備PAMAMNPs和PAMAM-FANPs,PAMAMNPs的粒徑為(147±18.2)nm,PAMAM-FA的粒徑為(151±17.4)nm(圖1),所制備的NPs均一性較好。PAMAMNPs和PAMAM-FANPs的Zeta電位分別為(34.9±6.2)mV和(36.4±7.4)mV。

2.2 HepG2細胞攝取NPs的濃度確定

如圖2所示,MTT法檢測顯示,HepG2細胞在PAMAMNPs和PAMAM-FANPs的濃度<0.2mg/mL時的細胞存活率在83%以上,細胞生存狀況良好,隨著NPs濃度的增加細胞的生存率不斷下降,當NPs的濃度在2mg/mL時,HepG2的存活率只有38%。細胞的生存狀況對細胞攝取NPs有重要的意義,NPs的濃度對細胞的生存影響小,可以降低由于其毒性而影響細胞攝取。

2.3 HepG2細胞攝取PAMAM-FANPs的觀察

圖3為激光共聚焦斷層掃描,固定X、Y坐標,沿Z軸掃描,掃描始于25.83μm即熒光最弱的細胞表面,掃描深度為6μm。通過觀察熒光強度來判斷細胞內(nèi)NPs的量,隨著掃描深度的增加,斷層面的熒光強度增加,當掃描深度在5μm左右的胞內(nèi)時熒光強度最強。通過斷層掃描證明PAMAMNPs能被HepG2細胞攝取,且主要分布于細胞質中,細胞核中未觀察到有明顯的分布。

2.4 HepG2細胞攝取NPs的定性與定量比較

HepG2細胞分別與PAMAMNPs和PAMAM-FANPs共溫育2h后,在熒光顯微鏡下可以明顯地看出:HepG2對PAMAM-FANPs的攝取要多于PAMAMNPs;通過流式細胞儀定量檢測,進一步表明HepG2細胞對AMAM-FANPs的攝取要多于PAMAMNPs(P<0.05,圖4)。綠熒光羅丹明B合并

2.5 NPs在荷HepG2瘤裸鼠的體內(nèi)分布研究

如圖5所示,采用Cy5標記PAMAMNPs和PAMAM-FANPs可以顯示NPs在體內(nèi)的分布情況,熒光強度越高所呈現(xiàn)的顏色越紅,表明組織攝取的NPs越多。在4h時PAMAMNPs和PAMAM-FANPs在裸鼠體內(nèi)的分布相差無幾,在腫瘤和結腸部的分布都較多。但隨著時間的延長,PAMAM-FANPs在腫瘤中的分布呈持續(xù)高熒光強度狀態(tài),其他臟器則呈下降趨勢,而PAMAMNPs在各臟器分布則呈現(xiàn)再分布的狀況,在其他臟器如肺中不斷增加。

3 討論

肝癌靶向給藥要求藥物有效地遞送到達結腸,減少藥物的不良反應。納米遞送靶向肝癌的研究是當今的一個熱點,各種靶向材料也是層出不窮,其中研究較多的有殼聚糖［7］、脂質體［8］、陽離子聚合物［9］等。本研究制備了PAMAM-FA,其上的PAMAM具有很好的生物相容性,可以降低網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬,從而延長其在體內(nèi)的分布時間［1］,PAMAM是被美國FDA批準應用于人體,已廣泛應用于藥物緩控釋系統(tǒng)和NPs的制備。PAMAM也因其良好的生物相容性被廣泛研究,所以本材料具有很好的應用前景。

葉酸是1種小分子維生素,其受體在許多腫瘤細胞中隨度表達,而在正常細胞中表達弱或不表達[12]。因則,將葉酸連接到聚合物納米膠束表面,可賦予納米膠束對腫瘤細胞的主動靶向性,可提高藥物在腫瘤組織中的濃度并降低其在正常組織中的濃度,減輕不良反應。

本研究采用采用復乳法制備PAMAM-FA,其粒徑在150nm左右,Zeta電位在+35mV左右,其較高的正電位易與表面為負電位的細胞膜結合,有利于其攝取。通過MTT實驗確定了對HepG2細胞較小毒性濃度為0.2mg/mL,在細胞攝取實驗研究中皆采用此濃度的NPs。HepG2細胞對PAMAM-FANPs有較好的攝取能力,應用熒光顯微鏡可以觀察到,經(jīng)過3h的攝取,HepG2細胞中有較多的羅丹明B標記的NPs,而激光共聚焦斷層掃描進一步顯示PAMAM-FANPs在HepG2細胞中的分布情況,表明NPs為細胞所攝取,而非黏附其表面,PAMAM-FANPs要多于PAMAMNPs,流式細胞術進一步證明PAMAM-FANPs對HepG2具有良好的靶向效果。本研究開展荷HepG2瘤裸鼠的體內(nèi)分布實驗,PAMAMNPs最初在腫瘤中分布較多,可能與腫瘤通透性增強與滯留(enhancedpermeabilityandrete ntion,EPR)效應［13］有關,PAMAM-FANPs在較短的時間內(nèi)未展現(xiàn)出更好的靶向性,但隨著時間的延長,體內(nèi)的NPs不斷的重新分布,FA的靶向效果不斷的呈現(xiàn),PAMAM-FANPs在腫瘤的分布一直處于較高的狀態(tài),在其他的臟器則分布越來越少,而PAMAMNPs的分布隨時間的增加在體內(nèi)的分布則沒有明顯的靶向效果。

本研究是對PAMAM-FA靶向肝癌的初步研究,為肝癌靶向納米遞送系統(tǒng)的構建提供初步的依據(jù)。

[1]黃英男,吳昊,沈錫中.葉酸受體在腫瘤靶向診斷和治療中的應用[J].復旦學報:醫(yī)學版,2012,39(1):74-79.

[2]郭林峰,蔣宗林,李東紅.葉酸受體介導靶向藥物載體的研究進展[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學,2013,21(5):1128-1131.[3]

[3]高海翟,包金,黃晶.葉酸和維生素B12與腫瘤關系的研究進展[J].廣東醫(yī)學,2014,35(10):1620-1621.