尚玥 于榮清 陳文敏 鮑錦庫

(1.四川大學生命科學學院 四川成都 610064;2.成都生物制品研究所有限責任公司 四川成都 610023)

23價肺炎球菌多糖疫苗含有經(jīng)提純的23種肺炎球菌莢膜多糖,能覆蓋感染肺炎球菌占比約90%的23種血清型人群。內(nèi)毒素是目前醫(yī)藥工業(yè)中最普遍和最主要的外源性熱源,控制內(nèi)毒素污染就等于控制熱源污染。因此內(nèi)毒素的檢測在多糖疫苗的生產(chǎn)過程中尤為重要。在適宜的條件下細菌內(nèi)毒素能激活鱟試劑中的凝固酶原,使鱟試劑產(chǎn)生凝集反應形成凝膠。細菌內(nèi)毒素濃度越高濁度變化越快,濁度變化符合二階反應動力學曲線。借助儀器進行動態(tài)濁度法試驗,可精確地檢測出供試品樣品的濁度。

1 材料與方法

1.1 供試品和儀器

供試品為PN2 T-CZ20130801,PN2 T-JZ20130801,PN17F T-CZ20130801,PN17F T-JZ20130801(均由國藥集團成都生物制品研究所提供)。儀器為ATi細菌內(nèi)毒素動態(tài)檢測儀。

1.2 鱟試劑靈敏度復核試驗

用細菌內(nèi)毒素檢查用水作為陰性對照,再梯度稀釋制成0.03125 EU/mL、0.0625 EU/mL、0.125EU/mL、0.25 EU/mL、0.5 EU/mL、1 EU/mL、2 EU/mL的標準溶液,依次加入已準備好的鱟試劑中,放入ATi細菌內(nèi)毒素動態(tài)檢測儀中運行軟件進行檢測。重復試驗3次。

1.3 干擾試驗(回收率試驗)同上選取0.03125 EU/mL、0.25 EU/mL、2 EU/mL的內(nèi)毒素標準溶液作為標準曲線。將細菌內(nèi)毒素標準品按照1 EU/mL、5 EU/mL和10 EU/mL的濃度作為樣品進行稀釋,放入ATi細菌內(nèi)毒素動態(tài)檢測儀中運行軟件進行檢測。重復試驗3次。

1.4 供試品的內(nèi)毒素檢查

制備標準曲線(同上),將供試品稀釋6倍作為樣品放入ATi細菌內(nèi)毒素動態(tài)檢測儀中運行軟件進行測定。

2 結(jié)果

2.1 鱟試劑靈敏度復核試驗結(jié)果

根據(jù)藥典要求,相關(guān)系數(shù)|γ|≥0.980;陰性對照的反應時間(TD)大于標準曲線最低濃度的反應時間(Tλ),試驗結(jié)果符合規(guī)定要求,見表1。

表1 鱟試劑靈敏度復核試驗結(jié)果

2.2 干擾試驗(回收率試驗)結(jié)果

重復試驗三次,根據(jù)藥典要求, |γ|≥0.980; TD大于Tλ,回收率R滿足50%≤R≤200%,變異系數(shù)CV%<10%。試驗結(jié)果符合規(guī)定要求,見表2。

表2 干擾試驗(回收率試驗)重復試驗

2.3 供試品的內(nèi)毒素檢查結(jié)果γ=-0.9968;TD>3600s, Tλ=1693.333s,TD>Tλ,肺炎球菌粗制、精制多糖檢測細菌內(nèi)毒素應小于300EU/mL,均符合藥典規(guī)定要求,見表3。

表3 供試品內(nèi)毒素檢查結(jié)果

3 討論

鱟試驗法已在醫(yī)藥工業(yè)上成為注射藥品生產(chǎn)質(zhì)控的最好方法之一。其優(yōu)點在于取樣方便、微量,操作簡便迅速,靈敏、準確,使得藥品生產(chǎn)過程熱原質(zhì)控能實現(xiàn)動態(tài)監(jiān)控和事前控制。同時由于溫度、pH值以及人員操作因素等影響,鱟試劑法存在一定比例的假陽性,經(jīng)過本試驗的靈敏性測試及干擾性試驗,在已確立的23價肺炎球菌多糖疫苗內(nèi)毒素檢測中進一步規(guī)范了試驗要求,對23價肺炎球菌多糖疫苗的質(zhì)量檢測提供了依據(jù)。

[1]諸衍立,張淑英,張淑梅.淺議鱟試劑法中不容忽視的幾個問題[J].中國醫(yī)院藥學雜志,2000,20(1).

[2]王煒紅,楊晶雪.細菌內(nèi)毒素檢測試驗方法的建立[J].中國消毒學雜志,2011,28(2).