張炫，唐道邦，陳之瑤，張友勝，程鏡蓉，劉學(xué)銘

1(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，江西南昌，330045)

2(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)部功能食品重點實驗室，廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室，廣東廣州，510610)

家禽血液含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，尤其是蛋白質(zhì)，含量可與瘦肉相媲美，因此血液素有“液體肉”之稱，具有很好的利用價值。新鮮雞血中大約含有80%左右的水分，蛋白質(zhì)含量大于17%，并且富含各種氨基酸、維生素、微量元素和其他一些活性物質(zhì)。隨著禽類養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，我國每年肉雞宰殺量已達(dá)10億多只，大量的雞血作為廢棄物排放，這不僅浪費了寶貴的資源，還對環(huán)境造成嚴(yán)重的污染。因此，充分利用禽血資源，大力開發(fā)其在食品、醫(yī)藥及飼料工業(yè)方面的有效產(chǎn)品，提高禽血綜合利用的經(jīng)濟(jì)效益有十分重要的意義［1］。

目前部分研究用酶降解畜禽Hb提高利用率，主要因為酶解法反應(yīng)溫和且對營養(yǎng)價值破壞小，但降解率較低、操作繁瑣、成本高［2］。如周娟娟等［3］先用木瓜蛋白酶水解，再風(fēng)味酶水解的復(fù)合酶分步水解工藝降解鴨血，水解液中的氨基酸含量有16.23%。而利用微生物降解禽血中Hb的方法，不僅投入低、操作簡單，且蛋白質(zhì)降解效果好，被公認(rèn)為血液綜合利用的一個方向［4-5］。如舒黛廉等［6］利用米曲霉發(fā)酵豬血，結(jié)果表明經(jīng)發(fā)酵后豬血中的蛋白質(zhì)和氨基酸含量顯著提高。國內(nèi)外的相關(guān)研究主要集中在利用微生物發(fā)酵畜禽血方面，即使利用霉菌發(fā)酵禽血，大多數(shù)也是應(yīng)用在飼料工業(yè)上［7］。付祖嬌等［8］利用高產(chǎn)蛋白酶的米曲霉為主發(fā)酵菌，再輔以其他菌株發(fā)酵豬血粉，獲得一種高蛋白飼料，蛋白質(zhì)含量高達(dá)69%，且富含其它營養(yǎng)成分。到目前為止，很少有文獻(xiàn)報道用霉菌發(fā)酵Hb做食品基料。

黑曲霉作為自然界廣泛分布的真菌，遺傳背景清晰，具有極高的蛋白質(zhì)分泌能力，是重要的工業(yè)發(fā)酵微生物，在工業(yè)酶制劑、有機(jī)酸發(fā)酵方面應(yīng)用廣泛，可生產(chǎn)酸性蛋白酶、纖維素酶、果膠酶等30多種酶制劑。此外，黑曲霉具有強(qiáng)大的聚合物降解酶系，能在各種廉價的培養(yǎng)基上快速生長和發(fā)酵，能在極低的pH下保持旺盛的代謝活性因而不易染菌，能適應(yīng)工業(yè)發(fā)酵中粗放的物料和理化環(huán)境，而且能產(chǎn)酸性蛋白酶A和酸性蛋白酶B，酸性蛋白酶的最佳反應(yīng)pH值較低(3～5)，與消化系統(tǒng)中的pH比較接近，可以彌補(bǔ)腸道內(nèi)源蛋白酶分泌不足，提高蛋白質(zhì)的消化率［9］。本文利用黑曲霉作為發(fā)酵菌，旨在獲得水溶性的小分子肽作為食品添加劑，為禽血高值化利用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

GIM3.452黑曲霉:購于廣東省微生物菌種保藏中心，培養(yǎng)溫度為25～28℃;試劑均為分析純。

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基:麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基。

種子培養(yǎng)基:蔗糖10 g，蛋白胨5 g，酵母膏5 g，KH2PO41 g，Na2CO30.5 g，NaCl 0.5 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 調(diào)至6.0。

Hb 發(fā)酵培養(yǎng)基:蔗糖 10.0 g，MgSO40.1g，ZnCl20.005 g，KH2PO42 g，NaCl 2 g，F(xiàn)eSO40.01 g，VB10.001 g，Hb 粉10 g，Span-20 1 mL，pH 調(diào)至6.0，無菌水1 000 mL。

1.3 主要儀器

Kjeltec 8400全自動凱氏定氮儀，F(xiàn)OSS分析儀器公司;生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司;HZQ-ZX全溫振蕩器，哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)有限公司;CR21GIII日立冷凍高速離心機(jī)，株式會社日立制作所;立式壓力蒸汽滅菌鍋，江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司;pHS-2C型精密酸度計，上海精科雷磁;UV-1800，日本島津;SW-CJ-1F超凈臺，蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 Hb粉制備

在接收新鮮雞血的儲存罐中添加檸檬酸鈉5 g/L，采集后置4℃、12 000 r/min離心15 min，棄上清液，得到下層沉淀加等體積的生理鹽水洗滌2次，再加等體積的超純水在超聲波儀中溶脹破壁10 min，放置10 min。然后在4℃、6 000 r/min離心15 min，棄沉淀獲得Hb上清液，真空冷凍干燥得到Hb粉［10］。

1.4.2 種子液的制備

將黑曲霉接種于麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基斜面，27℃下培養(yǎng)7 d。將10 mL無菌水倒入接種斜面，將孢子和菌絲刮起，接種到種子培養(yǎng)基，27℃搖床培養(yǎng)28 h。

1.4.3 霉菌生物量的確定

黑曲霉種子液培養(yǎng)28 h后，取10 mL種子液過濾，洗滌5次，在105℃干燥4 h，稱重，獲得的菌體干重7.8 mg/mL，以此為基準(zhǔn)，來確定每一批次的搖瓶接種量總的生物量一致。

1.4.4 粗酶的提取

發(fā)酵液離心取上清液，加(NH4)2SO4粉末，低飽和度10%的(NH4)2SO4除雜，高飽和度 90%的(NH4)2SO4得到以蛋白酶為主的沉淀物，在4℃下鹽析過夜，同一溫度下離心收集蛋白酶沉淀，復(fù)溶于50 mL適宜的保存酶活的pH緩沖液中，透析至無硫酸根，得到胞外粗酶液。

1.5 搖瓶發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化

1.5.1 單因子試驗

在初始Hb發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上進(jìn)行單因素設(shè)計，在其他組分不變的條件下，分別對不同濃度的MgSO4，KH2PO4和NaCl進(jìn)行優(yōu)化。培養(yǎng)條件:接種量6%，裝液量50 mL/250 mL，溫度27℃，轉(zhuǎn)速150 r/min，培養(yǎng)時間4 d。

1.5.2 培養(yǎng)成分篩選的正交試驗

根據(jù)上述單因素實驗結(jié)果，確定正交實驗的考察因素及其水平，選取碳源、Hb粉、MgSO4、NaCl、KH2PO4五個因素，設(shè)計5因素4水平的正交實驗，培養(yǎng)條件同上。如表1所示。

表1 黑曲霉發(fā)酵雞血Hb培養(yǎng)基組成優(yōu)化的正交試驗設(shè)計Table 1 Optimization of orthogonal design test on fermentation of the composition of chicken blood Hb medium by Aspergillus niger

1.5.3 搖瓶發(fā)酵條件的優(yōu)化

在上述優(yōu)化培養(yǎng)基組分的基礎(chǔ)上，分別對發(fā)酵培養(yǎng)條件中的溫度、接種量、初始pH值和培養(yǎng)時間進(jìn)行研究，選取不同的溫度、不同的裝液量、不同的接種量、不同的發(fā)酵時間對黑曲霉降解Hb的影響，優(yōu)化搖瓶發(fā)酵工藝條件。

1.6 黑曲霉對雞血Hb降解率的測定

1.6.1 蛋白酶活力的測定

Folin酚法［11］;蛋白酶以添加不同pH緩沖劑的酪蛋白溶液為底物，在40℃，pH4.0條件下酸性蛋白酶以及在40℃、pH7.2條件下中性蛋白酶每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸所需的酶量定義為1個酶活力單位，酶活力單位以μg/g表示。

酶活力=(A×K)/(t×W)

式中:A為樣品測得的OD值根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的酪氨酸質(zhì)量濃度，μg/mL;K為稀釋倍數(shù);t為反應(yīng)時間;W為每毫升粗酶液中含有發(fā)酵物的干重質(zhì)量。

1.6.2 黑曲霉對雞血Hb降解率的測定

發(fā)酵液經(jīng)布氏漏斗抽濾得上清液，置6 000 r/min離心15 min得到上清液即為可溶性氮樣品，凱氏定氮法測定可溶性氮含量。按下式計算Hb降解率［12］:

1.7 統(tǒng)計分析

所有試驗均重復(fù)3次，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，通過Microsoft Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對測定指標(biāo)進(jìn)行單因素方差分析，顯著性水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 Folin-酚測酶活

采用Folin-酚法以凈OD值為縱坐標(biāo)，酪氨酸的濃度為橫坐標(biāo)，測得的酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard absorbance curve of tyrosine

2.2 不同濃度的無機(jī)鹽對黑曲霉降解Hb的影響

由圖2可知，添加Mg2+的Hb降解率比未添加Mg2+的空白組相比顯著提高，隨著Mg2+濃度增加，Hb降解率呈現(xiàn)先升后降的趨勢，當(dāng)Mg2+濃度為0.2 g/L降解率達(dá)到最大值，繼續(xù)添加降解率反而降低，這可能是因為高于此濃度時酶活性受到抑制。

圖2 不同濃度的MgSO4對黑曲霉降解Hb的影響Fig.2 Effect of different concentrations of MgSO4 on degradation of hemoglobin by Aspergillus niger

圖3中添加Na+的Hb降解率也有明顯的提高，隨著Na+的增加，降解率呈先增后降的趨勢，當(dāng)濃度為4 g/L達(dá)到最大值，繼續(xù)增加降解率反而降低，這可能是因為Na+達(dá)到一定濃度時對酶的活性有抑制作用，也可能是Na+濃度太大破壞了水溶性蛋白質(zhì)的水化層，使得部分水溶性蛋白質(zhì)出現(xiàn)鹽析的現(xiàn)象。

圖3 不同濃度的NaCl對黑曲霉降解Hb的影響Fig.3 Effect of different concentrations of NaCl on degradation of hemoglobin by Aspergillus niger

從圖4可以看出，K+對黑曲霉降解Hb具有一定的影響，隨著K+的增加，降解率呈先升后降的趨勢，當(dāng)濃度2 g/L時，黑曲霉降解Hb的降解率最大，繼續(xù)增加K+下降趨勢明顯，甚至在4 g/L時比對照組的降解率都低，這主要因為無機(jī)鹽影響發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值進(jìn)而影響菌株產(chǎn)蛋白酶，KH2PO4本身是一種pH調(diào)節(jié)劑，黑曲霉在水解蛋白質(zhì)的過程中可能釋放出一些酸性、堿性蛋白或者黑曲霉自身產(chǎn)生一些能改善發(fā)酵環(huán)境的酸性、堿性物質(zhì)，改善黑曲霉的生活環(huán)境，少量的KH2PO4能起到很好的調(diào)節(jié)作用，但過量的KH2PO4可能使發(fā)酵液的環(huán)境過酸過堿，超過黑曲霉自身的調(diào)節(jié)范圍，生存環(huán)境的改變使得酶活性的半衰期縮短，酶的催化效率降低［13］。

圖4 不同濃度的KH2PO4對黑曲霉降解Hb的影響Fig.4 Effect of different concentrations of KH2PO4 on degradation of hemoglobin by Aspergillus niger

2.3 Hb發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

通過上述實驗初步確定無機(jī)鹽的最佳濃度，選取碳源、氮源、MgSO4、NaCl和KH2PO4作為正交試驗的5個因素，采用L16(45)正交表進(jìn)行優(yōu)化，實驗結(jié)果如表2所示。對此模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表3所示，5種因素對黑曲霉降解Hb有顯著的差異，從各因素的方差分析可知5種因素影響的主次關(guān)系為:B＞A＞C＞E＞D，即Hb粉 ＞蔗糖 ＞ MgSO4＞ NaCl＞KH2PO4，說明 Hb粉的濃度是影響降解率最顯著(P＜0.05)的因素，其次是蔗糖、MgSO4、NaCl和KH2PO4濃度。根據(jù)表2中的直觀分析得出培養(yǎng)基組分的最佳組合A3B1C4D2E4，即蔗糖20 g/L，Hb粉10 g/L，MgSO40.4 g/L，KH2PO42 g/L，NaCl 5 g/L。

表2 正交試驗的結(jié)果Table 2 The results of orthogonal test

表3 有重復(fù)觀測值正交設(shè)計試驗結(jié)果方差分析表Table 3 With repeated measurements analysis of variance of orthogonal test results

將實驗得到的培養(yǎng)基各組分的最佳條件組合在一起配制優(yōu)化培養(yǎng)基，與原培養(yǎng)基同條件培養(yǎng)。結(jié)果表明，培養(yǎng)基優(yōu)化前降解率為28.78%，培養(yǎng)基優(yōu)化后降解率為38.93%，優(yōu)化后Hb的降解率提高了10.15%，酶活比優(yōu)化前的487.5 μg/g提高到655.2 μg/g。

2.4 發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.4.1 接種量對黑曲霉降解Hb的影響

如圖5所示，隨著接種量的增加，降解率呈先升后降的趨勢，當(dāng)接種量為9%，黑曲霉的降解率最高。其原因是，當(dāng)接種量較低時，菌體產(chǎn)生的蛋白酶量較少，使得蛋白酶水解Hb的催化效率低;而當(dāng)接種量過量時，雖然會產(chǎn)生較多的蛋白酶，但是過多的菌體吸收了水解產(chǎn)生的小分子肽，減少發(fā)酵液中的水溶性氮，降解率反而較低。當(dāng)接種量為9%時，適量的菌體吸收小分子肽較少，而產(chǎn)生的蛋白酶可能與底物全部結(jié)合，使蛋白酶具有更高的催化效率，水解得到更多的水溶性蛋白及小分子肽。

圖5 不同的接種量對黑曲霉降解Hb的影響Fig.5 Effect of inoculum size on degradation of hemoglobin by Aspergillus niger

2.4.2 培養(yǎng)溫度對黑曲霉降解Hb的影響

溫度對黑曲霉的降解率有顯著影響，低溫抑制菌體的生長，影響酶的活性，使得酶催化的反應(yīng)效率降低，而過高的溫度會使部分酶失活［14］。如圖6所示，隨著溫度的升高，降解率持續(xù)增加;當(dāng)溫度為34℃時，降解率達(dá)到最大值，但菌體的量明顯少于30℃的量，其后溫度繼續(xù)增加，菌體的生長明顯受到抑制，蛋白酶分泌少，降解率顯著下降。這可能是因為溫度的升高對黑曲霉的生長有一定的抑制，但對酶的活性有促進(jìn)作用，從而使降解率提高。

圖6 不同的培養(yǎng)溫度對黑曲霉降解Hb的影響Fig.6 Effect of temperature on degradation of hemoglobin by Aspergillus niger

袁康培等報道1株黑曲霉所產(chǎn)酸性蛋白酶的最適溫度為45～55℃，最佳反應(yīng)溫度為50℃。詹深山等［15］報道1株黑曲霉產(chǎn)蛋白酶在35～50℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，酶活力逐漸增大，50℃時酶活力達(dá)到最大值，在50～65℃范圍內(nèi)，隨著溫度升高，酶活力急劇降低。

2.4.3 裝液量對黑曲霉降解Hb的影響

如圖7所示裝液量越少，降解率越高，裝液量越大，降解率越低。其原因可能是裝液少氣液比表面積越大，溶氧越多，黑曲霉生長旺盛，分泌較多的蛋白酶降解Hb，改善發(fā)酵液的環(huán)境;另一原因可能是裝液量越多其Hb含量高，而Hb的乳化能力較強(qiáng)，發(fā)酵培養(yǎng)基流動性差，發(fā)酵液黏度的改變一定程度的影響氧的傳遞速率，影響黑曲霉的生長，使得產(chǎn)酶減少，降低Hb 的降解率［16］。

圖7 不同的裝液量對黑曲霉降解Hb的影響Fig.7 Effect of liquid volume on degradation of hemoglobin by Aspergillus niger

2.4.4 發(fā)酵時間對黑曲霉降解Hb的影響

由圖8所示，接種后的第1天，發(fā)酵液的pH值迅速下降，分泌酸性蛋白酶，酶活增加，降解率顯著增長;其后pH開始緩慢升高，降解率增長趨勢減緩;隨后pH迅速升高，降解率增長趨勢進(jìn)一步減緩，但在第4天時，黑曲霉分泌中性蛋白酶，降解率的增長趨勢又明顯升高;此后在第6天時，pH值一直下降，而降解率仍然在升高;在最后3天時，降解率增長不明顯。黑曲霉對Hb降解是顯著的，在圖8中酶活力及pH有顯著變化，說明黑曲霉在發(fā)酵過程中產(chǎn)生了酸性蛋白酶和中性蛋白酶，并對其酶活進(jìn)行測定，酸性蛋白酶酶活最高達(dá)到 1 193.6 μg/g，中性蛋白酶757.1 μg/g，說明黑曲霉主要產(chǎn)酸性蛋白酶。

圖8 不同的發(fā)酵時間對黑曲霉降解Hb的影響Fig.8 Effect of fermentation time on degradation of hemoglobin by Aspergillus niger

結(jié)果表明，酸性蛋白酶的產(chǎn)生促使Hb水解，隨著pH值升高，酸性蛋白酶活逐漸受到抑制，從而減緩Hb降解率的增長趨勢;此外，也有可能因為菌體生長吸收過多的小分子肽導(dǎo)致降解率增長緩慢。其后，pH值迅速升高降解率繼續(xù)升高，說明生長環(huán)境的改變使得黑曲霉產(chǎn)生相應(yīng)的誘導(dǎo)酶-中性蛋白酶，Hb繼續(xù)水解，釋放一些堿性小肽;隨著發(fā)酵時間延長，菌體生長進(jìn)入到穩(wěn)定期，pH上升緩慢，中性蛋白酶繼續(xù)發(fā)揮其水解作用，降解率的增長顯著;培養(yǎng)到后期時，營養(yǎng)成分的匱乏使得菌體利用碳源產(chǎn)生酸性物質(zhì)。有文獻(xiàn)報道，黑曲霉是檸檬酸、葡糖酸和沒食子酸等的主要生產(chǎn)菌［17］。外界的生長環(huán)境越來越惡劣，黑曲霉進(jìn)入衰亡期，產(chǎn)酶減少，酶活受到抑制，自身產(chǎn)生一些次級代謝產(chǎn)物，如分泌一些酸性物質(zhì)抑制其他菌體的生長，菌體開始自溶死亡，菌絲球開始變小，釋放菌體體內(nèi)的一些小分子肽、酶和可溶性蛋白等物質(zhì)。當(dāng)發(fā)酵到后期時，菌絲球消失，雖然降解率還在提高，可能是因為菌體自溶增加了可溶性氮的含量，但是黑曲霉在衰亡期產(chǎn)生的發(fā)酵液可能會對它作為食品基料添加劑有一定的影響［18］。因此，最佳的發(fā)酵時間為7 d。

3 結(jié)論

本實驗通過對黑曲霉發(fā)酵雞血Hb的培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，降解率由28.8%提高到38.9%，酸性蛋白酶活比優(yōu)化前的 487.5 μg/g 提高到 655.2 μg/g，說明發(fā)酵培養(yǎng)基中各組分的濃度對黑曲霉的降解率和酶活有顯著影響;在此基礎(chǔ)上對黑曲霉的發(fā)酵條件進(jìn)行了初步優(yōu)化，優(yōu)化發(fā)酵工藝后，降解率提高到46.8%。該發(fā)酵工藝與利用酶系降解Hb相比具有投入低、操作簡單，蛋白質(zhì)降解效果好。江霞等［19］報道了采用木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、菠蘿蛋白酶、胰酶、風(fēng)味蛋白酶、復(fù)合蛋白酶7種酶，分別對豬血進(jìn)行水解，其中胰酶降解效果最好，水解度達(dá)到38.72%。因此，黑曲霉發(fā)酵Hb比用酶系降解Hb制備多肽優(yōu)勢明顯，降解效果好，對Hb多肽的制備工藝提供理論支持。

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