高磊，謝晶，葉藻，張寧，汪逸麟，高忱岳陽

(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海，201306)

2011年，中國肉雞產(chǎn)品的總消費(fèi)量是1 365.6萬t，占世界比重的16.35%，成為僅次于豬肉的第二大肉類消費(fèi)品［1］。近年來，動(dòng)物性流感H7N9的爆發(fā)［2］致使中國雞肉消費(fèi)結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯變化，活禽市場(chǎng)備受質(zhì)疑，消費(fèi)者逐漸開始選擇購買冷鮮雞。但雞經(jīng)屠宰、加工、運(yùn)輸后，在冷藏過程中由于細(xì)菌的大量生長繁殖，會(huì)導(dǎo)致雞肉品質(zhì)劣化，從而限制了冷鮮雞的貨架期。已有大量研究表明，假單胞菌、腸桿菌、熱死環(huán)絲菌、乳酸菌和不動(dòng)桿菌等是導(dǎo)致冷鮮肉腐敗的主要微生物［3-6］。這些較其他微生物生長更快、腐敗能力更強(qiáng)的微生物被稱為優(yōu)勢(shì)腐敗菌［7］，是對(duì)食品腐敗變質(zhì)起主導(dǎo)作用的細(xì)菌。因此，研究冷鮮雞中優(yōu)勢(shì)腐敗菌的特性對(duì)于冷鮮雞的保鮮具有重要意義。

本實(shí)驗(yàn)選用冷藏變質(zhì)的冷鮮雞，以其腿肉為研究對(duì)象，先采用平板劃線分離和感官評(píng)價(jià)方法對(duì)冷鮮雞腿肉中的優(yōu)勢(shì)腐敗菌進(jìn)行分離篩選，再根據(jù)菌落形態(tài)、菌體形態(tài)、生理生化實(shí)驗(yàn)以及16S rDNA序列分析對(duì)菌株進(jìn)行鑒定。最后，重新將其接種至滅菌肉塊，且以TVB-N產(chǎn)量因子Y(TVB-N/CFU)作為各優(yōu)勢(shì)腐敗菌腐敗能力的定量指標(biāo)，進(jìn)一步研究優(yōu)勢(shì)腐敗菌的腐敗特性。

1 材料與方法

1.1 原料

實(shí)驗(yàn)所用冷鮮雞購于上海農(nóng)工商超市(臨港新城店)冷鮮肉專柜，經(jīng)8天冷藏變質(zhì)后取腿肉。

1.2 培養(yǎng)基與試劑

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、假單胞菌CFC選擇性培養(yǎng)基、VRBDA-腸道菌瓊脂培養(yǎng)基、MRS瓊脂培養(yǎng)基、STAA培養(yǎng)基、MSA-甘露醇高鹽瓊脂、精氨酸水解酶培養(yǎng)基、葡萄糖氧化發(fā)酵培養(yǎng)基:青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。

瓊脂糖、細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒、用于PCR擴(kuò)增的全套試劑及合成的擴(kuò)增引物，生工生物工程(上海)股份有限公司;1%鹽酸二甲基對(duì)苯二胺溶液、3%H2O2，青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司;NaCl、MgO、H3BO3、HCl(均為分析純)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

LDZX-50KE高壓滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠;VS-1300L-U潔凈工作臺(tái)，蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;DHP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司;PowerPac Basic電泳儀、Universal Hood II凝膠成像儀，BIO-RAD公司;Kjeltec8400全自動(dòng)凱氏定氮儀，丹麥FOSS公司;Mastercycler6325 PCR擴(kuò)增儀、5427R離心機(jī)，EPPENDORF公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 腐敗菌的分離純化

在無菌環(huán)境下從變質(zhì)的冷鮮雞中隨機(jī)取10 g雞腿肉，用無菌剪刀剪碎，加到90 mL無菌生理鹽水中，封口后振蕩30 min，取上清液1 mL進(jìn)行10倍梯度稀釋，選擇3個(gè)合適的稀釋度，每個(gè)稀釋度做3次重復(fù)，傾注于含有不同選擇培養(yǎng)基的平板中，培養(yǎng)基的選擇及培養(yǎng)條件見表1。

表1 各菌的選擇性培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件Table 1 Culture media and conditions of different bacteria

從上述不同選擇培養(yǎng)基的平板中，挑取各種典型生長的菌落，然后在各自的培養(yǎng)基上反復(fù)進(jìn)行平板劃線分離，得到純化的單菌落［8］，最后于斜面培養(yǎng)基保存。

1.4.2 優(yōu)勢(shì)腐敗菌的篩選

將分離純化的各菌株重新培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后，用無菌生理鹽水制成菌懸液［9］，搖勻，利用血球計(jì)數(shù)板直接測(cè)定菌液濃度［10］，調(diào)整菌液濃度為105～106CFU/mL。用無菌剪刀將冷鮮雞腿肉分割成30 g左右大小均勻的肉塊后，先將75%酒精噴在其表面，靜置10 s后用無菌水沖洗，再在超凈臺(tái)上用酒精燈對(duì)其進(jìn)行表面滅菌，然后浸泡于調(diào)整過的菌液30 s后取出放入無菌自封袋中，每種菌株接種2個(gè)肉塊，以2個(gè)未接種過的肉塊作對(duì)照于4℃下貯藏。根據(jù)肉塊的色澤、黏度、彈性和氣味，每天進(jìn)行感官評(píng)價(jià)［11-12］，將腐敗最快的肉塊所接種的菌株作為篩選出的優(yōu)勢(shì)腐敗菌，對(duì)其進(jìn)行菌種鑒定并測(cè)定該菌對(duì)冷鮮雞腿肉的腐敗能力。

1.4.3 優(yōu)勢(shì)腐敗菌的鑒定

1.4.3.1 觀察菌落特征和菌體形態(tài)

菌落特征:菌落大小(細(xì)如針尖、小、中等、大);質(zhì)地(堅(jiān)硬、干燥、濕潤);邊緣形狀(整齊、星狀、楓葉狀、樹葉狀等);光滑程度(粗糙、光滑、黏液型);透明度(透明、半透明、不透明);菌落顏色。

通過革蘭氏染色、鞭毛染色及芽孢染色，對(duì)重新培養(yǎng)18～24 h長勢(shì)好的單菌落進(jìn)行顯微鏡觀察。菌體形態(tài):細(xì)胞形態(tài)(短桿、長桿及球狀等);革蘭氏染色分陰性和陽性;鞭毛的著生部位(周生、側(cè)生和端生);芽孢的生長位置和情況。

1.4.3.2 生理生化試驗(yàn)

根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》［13］和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》［14］對(duì)各菌株進(jìn)行氧化酶、過氧化氫酶、葡萄糖氧化發(fā)酵(O/F)和精氨酸雙水解酶實(shí)驗(yàn)。

1.4.3.3 DNA的提取

挑取重新培養(yǎng)18～24 h的單菌落至液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，采用細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒直接提取DNA，提取的DNA作為該菌株的擴(kuò)增模板，于-20℃保存待下一步實(shí)驗(yàn)。

1.4.3.4 16S rDNA的PCR擴(kuò)增

以提取的DNA作為模板，采用通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’)來擴(kuò)增目的片段的基因［15］。采用25 μL體系進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，即 Taq PCR Master Mix(2 × )12.5 μL、ddH2O 9.5 μL、27F 上游引物和1492R下游引物各1 μL及模板 DNA 1 μL。PCR擴(kuò)增程序［15］為:94℃預(yù)變性4 min;94℃變性1 min，58℃退火1 min，72℃延伸2 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min。用1×TAE緩沖液配制2%瓊脂糖凝膠，取3 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，再用溴化乙錠(EB)對(duì)其染色后，在凝膠成像儀中觀察電泳結(jié)果并拍攝電泳圖譜，每種菌株均獲得長度為1500 bp左右的條帶，最后將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物委托生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.4.3.5 DNA測(cè)序和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

登陸網(wǎng)站(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，將測(cè)序所得16S rDNA序列與核酸序列數(shù)據(jù)庫中已知序列進(jìn)行同源比對(duì)，從中選取若干個(gè)相似性高的菌株序列，使用MEGA6.06軟件，通過鄰接法(Neighbor-Joining)做1 000次隨機(jī)抽樣構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹［16］。

1.4.4 優(yōu)勢(shì)腐敗菌腐敗能力的測(cè)定

將篩選所得的優(yōu)勢(shì)腐敗菌按照1.4.2節(jié)的方法制得一定濃度的菌懸液，接種于滅菌的肉塊后放入無菌自封袋中4 ℃貯藏。在第1、2、4、6、8天時(shí)，以未接種過的肉塊作對(duì)照，每組各取2個(gè)肉塊測(cè)定菌落總數(shù)［17］和揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)［18］。將 TVB-N 產(chǎn)量因子Y(TVB-N/CFU)作為各優(yōu)勢(shì)腐敗菌腐敗能力的定量指標(biāo)［19］，公式如下:

1.4.5 數(shù)據(jù)分析

序列拼接采用DNASIS 3.0;DNA序列的分析，同源性比較用ClUSTAL W 2.0.10;系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建用MEGA 6.06軟件。數(shù)據(jù)采用3次平行試驗(yàn)的平均值，結(jié)果用平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差表示;曲線采用OriginPro 9.0繪制;利用SPSS 19.0進(jìn)行差異顯著性分析，P＜0.05表示顯著差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 優(yōu)勢(shì)腐敗菌的篩選

將變質(zhì)冷鮮雞腿肉的稀釋液傾注于含有不同選擇培養(yǎng)基的平板，從中挑取典型生長的菌落共17株。其中在假單胞菌瓊脂培養(yǎng)基中挑了6株、VRBDA培養(yǎng)基4株、MSA培養(yǎng)基3株、STAA培養(yǎng)基4株、MRS培養(yǎng)基0株。經(jīng)反復(fù)劃線分離純化后制成一定濃度的菌懸液，接種至新鮮的冷鮮雞腿肉。每天進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，感官可接受性逐漸降低，發(fā)現(xiàn)經(jīng)菌株J3、S1、M3、V1、J1接種過的肉塊感官得分最低，腐敗較快。其中J3和J1源自假單胞菌瓊脂培養(yǎng)基、S1源自STAA培養(yǎng)基、M3源自MSA培養(yǎng)基、V1源自VRBDA培養(yǎng)基。第4天開始，表面無光澤，外表濕潤不粘手，肌肉稍有彈性，略有異味;到第7天，色澤暗淡呈褐色，外表濕潤沾手，肌肉失去彈性，異味較強(qiáng)，肉塊已明顯腐敗。不同的細(xì)菌分解利用糖類、脂肪類和蛋白質(zhì)類物質(zhì)的能力不同，因此其代謝產(chǎn)物和腐敗能力也不同。因此，對(duì)篩選出的5 株優(yōu)勢(shì)腐敗菌 J3、S1、M3、V1、J1，進(jìn)行菌種鑒定并測(cè)定該菌對(duì)冷鮮雞腿肉的腐敗能力。

2.2 優(yōu)勢(shì)腐敗菌的鑒定

2.2.1 菌落特征和菌體形態(tài)

通過革蘭氏染色后鏡檢，觀察各菌體的形態(tài)結(jié)構(gòu)及其在固體培養(yǎng)基上的菌落特征，結(jié)果見表2。

表2 菌落特征以及菌體形態(tài)Table 2 Characteristics of bacterial colony and shape of strains

2.2.2 生理生化實(shí)驗(yàn)

根據(jù)食品微生物鑒定圖譜以及《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》［13］，通過鏡檢各種菌在顯微鏡下的菌體形態(tài)、革蘭氏染色情況等，結(jié)合表3的生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，初步鑒定J3為假單胞菌屬，S1為環(huán)絲菌屬，M3為葡萄球菌屬，V1為無色桿菌屬，J1為腸桿菌科。

表3 生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Physiological characteristics of spoilage bacteria

2.2.3 優(yōu)勢(shì)腐敗菌16S rDNA的PCR擴(kuò)增

分別提取5株菌的基因組DNA后，以其總DNA為模板利用PCR擴(kuò)增其16S rDNA基因片段。結(jié)果如圖1所示，5個(gè)樣品均獲長度在1 500 bp左右的條帶，最后將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

圖1 菌株的16S rDNA PCR電泳圖譜Fig.1 PCR amplification of 16S rDNA genes

2.2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

將測(cè)序所得16S rDNA序列與核酸序列數(shù)據(jù)庫中已知序列進(jìn)行比對(duì)，選取相似性高的菌株序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖2所示。不難發(fā)現(xiàn):J1與沙雷氏菌屬的Serratia grimesii同源性最高;J3與假單胞菌屬的Pseudomonas pseudoalcaligenes同源性最高;M3與葡萄球菌屬的Staphylococcus saprophyticus同源性最高;V1與無色桿菌屬的Achromobacter xylosoxidans同源性最高;S1與環(huán)絲菌屬中的 Brochothrix thermosphacta同源性最高。Pseudomonas pseudoalcaligenes屬于假單胞菌屬，是食品典型腐敗菌。雞肉在冷藏過程中，它由于更加適應(yīng)低溫的環(huán)境，在肉類上極易繁殖，且具有很強(qiáng)的產(chǎn)生氨等腐敗產(chǎn)物的能力，是冷藏畜肉中存在的優(yōu)勢(shì)菌［4，20］。Serratia grimesii屬沙雷氏菌屬，它是革蘭氏陰性菌并兼性厭氧。主要利用該菌中酶對(duì)自由氨基酸發(fā)生脫羧基作用而形成生物胺［21］。當(dāng)人體攝入過量生物胺時(shí)，可引起疾病(如頭痛、傷寒、肺炎、腸炎等)，它也有一定的食物中毒危險(xiǎn)性，因此應(yīng)嚴(yán)格控制Serratia grimesii的生長繁殖。Staphylococcus saprophyticus是葡萄球菌屬的一種，在自然界中分布很廣，是常見的腐敗菌。該菌主要起源于禽類本身［22］，但在加工、運(yùn)輸?shù)冗^程中繁殖機(jī)會(huì)大大增加。Achromobacter xylosoxidans屬于無色桿菌屬，廣泛分布在水和土壤中。雞肉表面發(fā)黏，是由于無色桿菌在肉的表面生長繁殖，產(chǎn)生黏液的結(jié)果。在冷藏溫度和高濕度下有利于其生長。同時(shí)，無色桿菌也能分解冷鮮雞中的某些脂肪而加速脂肪的氧化作用，引起肉類酸敗。Brochothrix thermosphacta是革蘭氏陽性兼性厭氧菌，在4℃下能較快地生長，被認(rèn)為是冷藏溫度下引起冷卻肉腐敗變質(zhì)的主要微生物之一［3，23］。在有氧條件下，較高數(shù)量的熱死環(huán)絲菌會(huì)產(chǎn)生乙偶姻、雙乙酰、甲基丁醇等令人不愉快的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物［24］。這些分離出的腐敗菌是冷鮮雞中常見腐敗菌，它們主要是由于雞在屠宰、運(yùn)輸和銷售和包裝過程中污染，且在冷藏過程仍有殘存且大量繁殖，導(dǎo)致冷鮮雞最終腐敗變質(zhì)。冷鮮雞中的優(yōu)勢(shì)腐敗菌相對(duì)于冷卻豬肉來說，情況基本一致，但乳酸菌、不動(dòng)桿菌以及莫拉氏菌等常見冷卻肉腐敗菌并未檢出，或其對(duì)雞肉的腐敗能力不強(qiáng)。

圖2 基于16S rDNA序列同源性的菌株系統(tǒng)發(fā)育樹圖Fig.2 Phylogenetic tree of strains based on 16S rDNA sequences

2.3 接種肉塊的菌落總數(shù)和TVB-N變化

將篩選所得5株優(yōu)勢(shì)腐敗菌重新接種至滅菌的肉塊于4 ℃貯藏，分別在第1、2、4、6、8 天時(shí)，以未接種過的肉塊作對(duì)照(CK)，每組各取2個(gè)肉塊測(cè)定菌落總數(shù)和TVB-N變化，結(jié)果見圖3和圖4。

肉類食品的腐敗變質(zhì)是由肉中的酶以及微生物的作用，使蛋白質(zhì)分解，脂肪氧化而引起的，微生物的大量繁殖是造成肉類食品腐敗的主要根源。因此，肉中菌落總數(shù)是表示肉品腐敗程度的一個(gè)重要指標(biāo)。圖3所示，在整個(gè)4℃貯藏過程中，接種肉塊和對(duì)照組中的菌落總數(shù)呈總體增長趨勢(shì)，且接種肉塊的菌落總數(shù)均高于對(duì)照組。其中，接種假單胞菌的肉塊菌落總數(shù)增長速度較快，其他4株腐敗菌也有不同程度的增長。在貯藏末期，也達(dá)到了較高的對(duì)數(shù)值，各接種塊的菌落總數(shù)均超過9.1(lg(CFU/g))，與對(duì)照組8.3(lg(CFU/g))有顯著差異(P＜0.05)。貯藏前5天，菌落總數(shù)增長明顯，5天后開始進(jìn)入穩(wěn)定期。以上現(xiàn)象表明:食品原有的嗜冷菌在低溫貯藏期間，會(huì)利用蛋白質(zhì)和營養(yǎng)物質(zhì)良好地生長，菌落總數(shù)急劇增加，且優(yōu)勢(shì)腐敗菌的存在會(huì)進(jìn)一步加速冷鮮肉腐敗現(xiàn)象的產(chǎn)生。但微生物因生長環(huán)境變差(代謝產(chǎn)物積累、排出毒素、營養(yǎng)缺乏等)生長緩慢從而進(jìn)入穩(wěn)定期。

圖3 接種優(yōu)勢(shì)腐敗菌的滅菌肉塊在4℃貯藏菌落總數(shù)的變化Fig.3 Microbial counts change of sterile chicken blocks inoculated with dominant spoilage bacteria stored at 4℃

揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)是指肉及肉制品水浸液在堿性條件下能與水蒸氣一起蒸餾出來的總氮量，是評(píng)價(jià)肉及其制品新鮮度的一項(xiàng)重要指標(biāo)。它是由于微生物的繁殖使其進(jìn)入肉的深層組織，從而引起的脫羧、脫氨作用導(dǎo)致蛋白質(zhì)的分解而形成的產(chǎn)物。在冷鮮雞中分解游離出的鹽基氮類物質(zhì)主要有:伯胺、仲胺、叔胺包括尸胺、腐胺、酪胺、精胺、氨等［25］。評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)［26］為:一級(jí)鮮度≤15 mg/100 g，二級(jí)鮮度(可食范圍)≤25 mg/100 g，變質(zhì)肉 ＞25 mg/100 g。在4℃貯藏期間，接種優(yōu)勢(shì)腐敗菌的滅菌肉塊TVB-N的變化如圖4所示，接種腐敗菌的肉塊在4℃貯藏期間TVB-N值逐漸增大，貯藏初期，TVB-N值變化不明顯。但到了第5天，隨著腐敗菌的生長繁殖各組肉塊的TVB-N值明顯增加，且均超過了15 mg/100 g，已超過一級(jí)鮮度，肉品開始腐敗變質(zhì)。到了貯藏末期，各組肉塊的TVB-N值均超過24 mg/100 g，肉質(zhì)基本達(dá)到腐敗程度。其中J3組的TVB-N值高達(dá)37.89 mg/100 g，其次是 J1組35.47 mg/100 g，而 V1組的TVB-N值25.75 mg/100 g略高于對(duì)照組的24.84 mg/100 g，表明 V1(Achromobacter xylosoxidans)分解肉中蛋白質(zhì)加速其氧化作用不大，腐敗能力較弱，而J3(Pseudomonas pseudoalcaligenes)利用肉中營養(yǎng)物質(zhì)產(chǎn)生較多代謝產(chǎn)物，腐敗能力強(qiáng)。因此，除了V1組，接種過腐敗菌的各組肉塊TVB-N值與對(duì)照組有顯著差異(P＜0.05)，說明腐敗菌的生長繁殖是導(dǎo)致TVB-N產(chǎn)生的主要原因。

圖4 接種優(yōu)勢(shì)腐敗菌的滅菌肉塊在4℃貯藏TVB-N的變化Fig.4 Total volatile base nitrogen change of sterile fish blocks inoculated with spoilage bacteria stored at 4℃

2.4 優(yōu)勢(shì)腐敗菌的腐敗能力分析

本研究通過計(jì)算將TVB-N值與菌落總數(shù)結(jié)合，用TVB-N產(chǎn)量因子Y(TVB-N/CFU)定量表示各腐敗菌的腐敗能力［23］。由表4可知，接種腐敗菌 J3(Pseudomonas pseudoalcaligenes)的 YTVB-N值最大2.06/(10-8mg TVB-N/CFU)，明顯高于其他4株，而接種腐敗菌V1(Achromobacter xylosoxidans)YTVB-N值最小0.91/(10-8mg TVB-N/CFU)。

表4 各種優(yōu)勢(shì)腐敗菌的TVB-N產(chǎn)量因子Table 4 Yield factor of TVB-N of dominant spoilage bacteria

腐敗菌的腐敗能力差異源自其利用肉中營養(yǎng)物質(zhì)產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的能力不同。結(jié)果表明，在4℃貯藏期間，腐敗菌J3對(duì)冷鮮雞腿肉的腐敗能力較強(qiáng)，其次是J1(Serratia grimesii)和 M3(Staphylococcus saprophyticus)，而V1和S1(Brochothrix thermosphacta)腐敗能力相對(duì)較弱。該結(jié)果可為今后針對(duì)性地選擇保鮮劑保鮮冷鮮雞提供一定理論依據(jù)。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)從變質(zhì)冷鮮雞的腿肉中分離并通過感官評(píng)價(jià)篩得5株優(yōu)勢(shì)腐敗菌，經(jīng)菌落特征、菌體形態(tài)、生理生化實(shí)驗(yàn)以及16S rDNA 序列分析，J3、S1、M3、V1、J1分別鑒定為:Pseudomonas pseudoalcaligenes、Brochothrix thermosphacta、Staphylococcus saprophyticus、Achromobacter xylosoxidans、Serratia grimesii。進(jìn)一步研究表明，J3對(duì)冷鮮雞腿肉的腐敗能力較強(qiáng)，其次是J1和M3，而V1和S1的腐敗能力相對(duì)較弱。

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