張甫生，胡國洲，田美玲，李曼珊，闞建全

(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715)

葡萄糖異構(gòu)酶(Glucose isomerase，簡稱 GI)，能將D-木糖、D-葡萄糖、D-核糖等醛糖轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的酮糖，是工業(yè)上大規(guī)模制備果葡糖漿的關(guān)鍵轉(zhuǎn)化酶［1-2］。因果葡糖漿具有溶解度高、保濕性好、抗結(jié)晶性好及風(fēng)味濃郁等特點，現(xiàn)作為甜味劑已逐步取代了蔗糖的地位［3-4］。隨著果葡糖漿使用量增長，國內(nèi)外市場上對葡萄糖異構(gòu)酶的需求也在不斷增加;然而葡萄糖異構(gòu)酶在應(yīng)用過程中存在酶活性低、再生困難、壽命短及價格昂貴等問題，極大地限制了其工業(yè)化應(yīng)用，也增加了實際生產(chǎn)成本，成為制約果葡糖漿產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸問題。為此，國內(nèi)外企業(yè)及研究機(jī)構(gòu)都迫切地期望通過酶改性技術(shù)，達(dá)到提高酶活、延長酶壽命、降低生產(chǎn)用酶量的目的。

近年來，微波處理等作為食品工業(yè)殺菌與鈍酶的加工手段漸入人們視野［5-6］。在應(yīng)用微波對酶進(jìn)行處理的過程中發(fā)現(xiàn)，一些較低強(qiáng)度的微波處理能迅速地提高酶的活性，如Yu等對微波活化脂肪酶進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)與普通加熱相比，480 W的微波處理可使諾維信脂肪酶活性提高1.5倍［7］;Lukasiewicz等研究顯示，微波處理可使γ-淀粉酶的初始反應(yīng)速率最大可提高2.5倍［8］;Roy等研究表明微波的非熱效應(yīng)可使蛋白酶初始反應(yīng)速率提高2.1～4.7倍，同時與pH及鹽離子等還有協(xié)同增效的作用［9］。此外，微波處理還可以使纖維素酶［10］、S-腺苷高半胱氨酸水解酶［11］、α-半乳糖苷酶［12］及 β-葡糖苷酶［12］等酶的活性增強(qiáng)。這就顯示在適當(dāng)條件下微波處理對食品中酶具有活化效果，可以對酶進(jìn)行活化改性，來提高酶活。但上述這些激活研究大多集中于對單一游離酶活性提高方面，未進(jìn)一步涉及其酶學(xué)性質(zhì)等方面變化。

在微波處理對葡萄糖異構(gòu)酶活化方面，除本團(tuán)隊前期報道微波處理激活游離葡萄糖異構(gòu)酶［13］外，目前尚未見其他相關(guān)的研究報道。因酶在經(jīng)過固定化之后，固定化酶的活性中心、空間結(jié)構(gòu)和電荷狀態(tài)等發(fā)生改變［2，4］，微波處理對固定化后葡萄糖異構(gòu)酶的影響也定會有所改變。因此，本文以固定化葡萄糖異構(gòu)酶為研究對象，探討微波處理對其活性及相關(guān)酶學(xué)性質(zhì)的影響，以期為微波處理對固定化酶活化改性提供理論基礎(chǔ)，并推動微波處理等非熱加工技術(shù)在酶改性領(lǐng)域中的合理應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄糖異構(gòu)酶(≥10萬U/g)，武漢銀河化工有限公司;固定化葡萄糖異構(gòu)酶，以活化硅膠為載體自制(酶活125 U/g)。

咔唑、半胱氨酸鹽酸鹽、葡萄糖、Na2HPO4、NaH2PO4、果糖、H2SO4、高氯酸、MgSO4、CoCl2等均為分析純，成都科龍試劑有限公司;硅膠(300目)，青島海洋化工廠分廠。

1.2 設(shè)備與儀器

MAS-Ⅱ型微波快速制樣系統(tǒng)(工作功率0～1 000 W，工作溫度25～250℃)，上海新儀公司;UV-2450型紫外分光光度計，日本島津公司;PB-10精密pH計，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;FA2004型電子天平，上海精科天平;SHZ-82A恒溫水浴振蕩器，江蘇金壇市恒豐儀器制造有限公司;DK-8D型三孔電熱恒溫水槽，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 固定化葡萄糖異構(gòu)酶的制備

取5 mg/mL葡萄糖異構(gòu)酶酶液30 mL，加入1 g干燥活化硅膠(硅膠活化參考 Song的方法［14］)，于25℃水浴振蕩器(170 r/min)中振蕩24 h，然后用去離子水充分洗滌，抽濾得到固定化葡萄糖異構(gòu)酶樣品，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 固定化葡萄糖異構(gòu)酶酶活力測定

采用半胱氨酸-咔唑法［3］。反應(yīng)體系為:0.2 mol/L pH7.0磷酸緩沖液10 mL，2 mol/L的葡萄糖混合溶液10 mL(含有0.05 mol/L Mg2+和0.01 mol/L Co2+，下同)，0.4 g固定化酶?；旌弦褐糜?0℃水浴中，反應(yīng)30 min后，迅速加入0.5 mol/L的高氯酸溶液2.5 mL終止反應(yīng)，后用半胱氨酸-咔唑法測定果糖含量，根據(jù)果糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計算固定化葡萄糖異構(gòu)酶的酶活力。固定化酶酶活力單位定義:在該反應(yīng)條件下，1 g固定化酶每分鐘將1 μmol葡萄糖異構(gòu)為果糖的微摩爾數(shù)為1個活力單位(U/g)。

1.3.3 微波處理對固定化葡萄糖異構(gòu)酶活性增強(qiáng)的影響

以10 mL 2%固定化酶+10 mL 2 mol/L的葡萄糖底物混合溶液為待處理液(均以pH 7.0緩沖液配制，下同)，以水浴加熱處理為對照，并以其酶活為100%，在微波處理溫度70℃和處理時間30 min的條件下，探討不同功率(200、300、400、600、800 W)微波處理對葡萄糖異構(gòu)酶活性增強(qiáng)的影響。

1.3.4 微波處理對固定化葡萄糖異構(gòu)酶的最適反應(yīng)溫度的影響

在固定微波處理功率400 W和處理時間30 min的條件下，探討不同微波處理溫度(55、65、70、75、80、85、90℃)對固定化葡萄糖異構(gòu)酶活性的影響，以最大酶活力為100%，分析其最適反應(yīng)溫度。

1.3.5 微波處理對固定化葡萄糖異構(gòu)酶的最適pH的影響

在固定微波處理功率400 W、處理溫度70℃和處理時間30 min的條件下，探討不同pH(5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0)對固定化葡萄糖異構(gòu)酶活性的影響，以最大酶活力為100%，分析其最適反應(yīng)pH。

1.3.6 微波處理對固定化葡萄糖異構(gòu)酶的Km值與Vmax的影響

以10 mL 2%固定化酶+10 mL一系列濃度(100、300、500、800、1 000、1 500 mmol/L)的葡萄糖底物混合溶液為待處理液，以水浴加熱處理為對照，在固定微波處理功率400 W、處理溫度70℃和處理時間30 min的條件下進(jìn)行微波處理，測定固定化酶活性。根據(jù)經(jīng)典的Michaelis-Menten動力學(xué)方程，運(yùn)用Lineweaver-Burk作圖［3］(雙倒數(shù)法)得到米氏方程，進(jìn)而利用米氏方程計算微波加熱處理條件下葡萄糖異構(gòu)酶的Km和Vmax。

1.3.7 金屬離子濃度對微波處理固定化葡萄糖異構(gòu)酶活性的影響

在固定微波處理功率400 W、處理溫度70℃和處理時間30 min的條件下，探討底物溶液中不同Mg2+濃度(0、0.001、0.01、0.05、0.08、0.1 mol/L)和Co2+濃度(0、0.001、0.001、0.002、0.005、0.01 mol/L)對固定化葡萄糖異構(gòu)酶活性的影響，以水浴對照初始酶活力為100%，比較分析底物中最適Mg2+和Co2+濃度。

1.3.8 微波處理固定化葡萄糖異構(gòu)酶的穩(wěn)定性分析

(1)固定化葡萄糖異構(gòu)酶的熱穩(wěn)定性分析

在固定微波處理功率400 W，處理溫度為30～90℃條件下保溫處理酶液1 h，冷卻到4℃后，測定固定化酶酶活，以最大酶活力為100%。分析比較微波加熱處理和水浴加熱對照處理下固定化葡萄糖異構(gòu)酶的熱穩(wěn)定性。

(2)固定化葡萄糖異構(gòu)酶的操作穩(wěn)定性分析

在固定微波處理功率400 W、處理溫度70℃和處理時間30 min的條件下進(jìn)行微波處理，測定固定化酶活性。而后將固定化酶收集，用去離子水洗滌干凈，置于4℃冰箱保存4 h后，再用同樣的方法進(jìn)行微波加熱處理并測定其活性。重復(fù)試驗15次，以初始酶活力為100%，比較固定化酶在微波加熱和水浴加熱條件下酶的操作穩(wěn)定性。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每組試驗均重復(fù)3次，試驗數(shù)據(jù)運(yùn)用OriginPro 8.0和Excel 2010進(jìn)行分析處理和圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 微波處理對固定化葡萄糖異構(gòu)酶活性增強(qiáng)的影響

由圖1可知，固定化葡萄糖異構(gòu)酶活性在不同功率微波處理后，酶活力均有所提高，說明固定化葡萄糖異構(gòu)酶在微波處理的條件下均被活化;但酶活力增幅呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，微波功率為200～400 W時，固定化葡萄糖異構(gòu)酶活性上升，并在400 W時達(dá)到最高為156.1 U/g，比對照水浴處理酶活(125.4 U/g)增加了24.5%;而當(dāng)微波功率增至600 W、800 W時，固定化酶酶活增幅降低，與對照相比酶活分別僅增加18.0%和15.5%。這可能是因為適當(dāng)?shù)奈⒉ㄌ幚砉β适姑钢心承┡c酶活力相關(guān)的功能基團(tuán)發(fā)生有序重排，從而使酶活力提高，而過高的處理功率使酶蛋白部分變性，進(jìn)而導(dǎo)致酶活性降低或增幅降低［7］。

圖1 微波處理對固定化葡萄糖異構(gòu)酶活性增強(qiáng)的影響Fig.1 Effect of microwave treatment on enhancing activity of immobilized glucose isomerase

2.2 微波處理對固定化葡萄糖異構(gòu)酶最適反應(yīng)溫度的影響

溫度是影響葡萄糖異構(gòu)酶活性的一個重要因素，在適宜的溫度范圍內(nèi)，葡萄糖異構(gòu)酶比較穩(wěn)定，當(dāng)偏離最適溫度后，酶就會發(fā)生熱變性而導(dǎo)致失活［15］。微波處理對固定化葡萄糖異構(gòu)酶最適溫度的影響見圖2。

圖2 微波處理對固定化葡萄糖異構(gòu)酶最適反應(yīng)溫度的影響Fig.2 Effect of microwave treatment on optimal temperature of immobilized glucose isomerase

從圖2可以看出，微波處理與水浴對照處理固定化葡萄糖異構(gòu)酶的最適反應(yīng)溫度分別為75℃和80℃;與水浴對照相比，在微波處理下固定化酶的最適反應(yīng)溫度降低了5℃，且其最適溫度范圍(酶活＞95%的溫度范圍)變小，水浴處理的固定化葡萄糖異構(gòu)酶最適溫度范圍為75～85℃，而微波處理后固定化葡萄糖異構(gòu)酶最適溫度范圍為75～80℃;這與前期游離酶的研究結(jié)果［13］正好相反，這可能與載體對固定化酶蛋白的保護(hù)作用有關(guān)，載體對酶蛋白分子構(gòu)象完整性自動進(jìn)行調(diào)整［1-2］，阻礙了微波處理對酶結(jié)構(gòu)的有序重排或加速無序結(jié)構(gòu)，從而使最適反應(yīng)溫度與最適溫度范圍降低。而同時在較高的反應(yīng)溫度范圍(80～90℃)內(nèi)，微波處理固定化酶的活力比對照處理下降較快，可能是在高溫條件下，微波處理更易使部分固定化葡萄糖異構(gòu)酶失活所致［16］。

2.3 微波處理對固定化葡萄糖異構(gòu)酶最適pH的影響

pH能影響酶分子活性部位上酸性或堿性氨基酸側(cè)基的解離狀態(tài)，從而影響酶活性中心與底物的結(jié)合或催化，進(jìn)而影響酶活性［17］;pH是影響酶活性的重要因素之一，當(dāng)介質(zhì)的pH值對最適宜值偏離較大時，還可導(dǎo)致酶的變性失活。由圖3可以看出，微波處理并未改變固定化葡萄異構(gòu)酶的最適pH范圍，微波處理和水浴處理的固定化葡萄異構(gòu)酶的最適pH范圍均為7.0～7.5，且均在pH7時酶活力最高。

圖3 微波處理對固定化葡萄糖異構(gòu)酶最適pH的影響Fig.3 Effect of microwave treatment on optimal pH of immobilized glucose isomerase

2.4 金屬離子濃度對微波處理固定化葡萄糖異構(gòu)酶活性的影響

葡萄糖異構(gòu)酶為金屬離子依賴性酶，其活性中心有Mg2+、Co2+的結(jié)合位點，在適宜的Mg2+、Co2+濃度條件下，葡萄糖異構(gòu)酶分子具有最佳的穩(wěn)定構(gòu)象和最高的活性［4］。不同金屬離子濃度對固定化葡萄糖異構(gòu)酶的影響，見圖4(a)與4(b)。

從圖4(a)與4(b)中可以看出，固定化葡萄糖異構(gòu)酶的活性均隨Mg2+與Co2+濃度增加，呈現(xiàn)先增加后穩(wěn)定的趨勢。對于Mg2+而言，微波處理與水浴對照處理的固定化葡萄糖異構(gòu)酶的活性在Mg2+濃度為0.001～0.05 mol/L時，活性隨Mg2+濃度增加而增加，濃度大于0.05 mol/L，酶活性趨于穩(wěn)定;對于Co2+而言，固定化葡萄糖異構(gòu)酶的活性在Co2+濃度為0～0.001 mol/L時，活性隨Co2+濃度的增加而增加;濃度大于0.001 mol/L時，酶活性趨于穩(wěn)定。因此，微波處理與水浴對照處理的最適Mg2+與Co2+濃度分別為0.05 mol/L和0.001 mol/L。此外，從圖4(a)與4(b)中也可以看出，微波處理固定化酶的活性均較水浴對照處理高，這與2.1結(jié)果一致，再次證明微波處理對固定化葡萄糖異構(gòu)酶有活化作用。

圖4 Mg2+(a)和Co2+(b)濃度對微波處理固定化葡萄糖異構(gòu)酶活性的影響Fig.4 Effect of Mg2+(a)and Co2+(b)on the activity of immobilized glucose isomerase treated by microwave

2.5 微波處理對固定化葡萄糖異構(gòu)酶的動力學(xué)參數(shù)影響

由經(jīng)典的Michaelis-Menten動力學(xué)方程，作圖法可得到米氏常數(shù)(Km)、最大反應(yīng)速率(Vmax)。經(jīng)作圖(圖5a與5b)與計算得出，微波處理下固定化葡萄糖異構(gòu)酶的Km為0.181 mol/L，Vmax為 8.1 ×10-4mol/(L·min);水浴對照處理固定化酶的Km為0.223 mol/L，Vmax為7.7×10-4mol/(L·min)。說明經(jīng)微波處理的固定化葡萄糖異構(gòu)酶與水浴對照處理的相比Vmax增大，Km降低，說明此時酶與底物親和力增大，其在飽和濃度下的限制反應(yīng)速度也增大。這可能是由于微波處理導(dǎo)致酶結(jié)構(gòu)變化，使酶的底物的親和力增加，葡萄糖異構(gòu)酶與底物結(jié)合更容易，從而表現(xiàn)較高的催化能力［9，18］。

圖5 微波處理(a)和水浴處理(b)固定化葡萄糖異構(gòu)酶的動力學(xué)方程圖Fig.5 Michaelis-Menten kinetics equation of immobilized glucose isomerase treated by microwave(a)and conventional heating(b)

2.6 微波處理固定化葡萄糖異構(gòu)酶的穩(wěn)定性分析

(1)固定化葡萄糖異構(gòu)酶的熱穩(wěn)定性分析

溫度它不僅可以影響酶蛋白的構(gòu)象、參與酶促反應(yīng)官能團(tuán)的解離狀態(tài)，而且還會影響到酶與底物的親和力，酶-底物絡(luò)合物的分解，甚至還會影響到酶與激活劑的親和力等，且與pH值等相比，在加工過程更不易控制［19］。固定化酶的熱穩(wěn)定性是其在工業(yè)化應(yīng)用中最重要的性質(zhì)之一。固定化酶熱穩(wěn)定性比較分析見圖6，從圖6可以看出，微波加熱條件下，固定化酶在70℃以下時，其殘余酶活也都是保持在80%以上，呈持續(xù)上升狀態(tài);而當(dāng)溫度大于70℃后，固定化酶的殘余酶活急劇下降，在90℃下降到55.54%;而在水浴加熱對照條件下，固定化酶在80℃以下時，其殘余酶活都是保持在80%以上，也呈持續(xù)上升狀態(tài)，當(dāng)溫度大于80℃后，固定化酶活力也開始迅速下降，在90℃下降到81.44%。說明在較低溫度 (微波處理＜70℃，水浴處理＜80℃)時，固定化酶的穩(wěn)定性較好;而在較高溫度下(微波處理＞70℃，水浴處理＞80℃)時，固定化酶活穩(wěn)定性不高且酶活開始急劇下降;而在更高溫度90℃時，微波加熱固定化酶活比對照水浴處理下降得更多，穩(wěn)定性顯著低于對照處理固定化酶活，說明高溫微波加熱對固定化葡萄糖異構(gòu)酶的穩(wěn)定性有顯著的影響，這可能是由于在高溫下微波促進(jìn)了酶從載體脫落減少了載體保護(hù)作用或微波其他非熱效應(yīng)所導(dǎo)致［11，16］?？傮w說來，雖然微波處理顯著地降低了固定化葡萄糖異構(gòu)酶在高溫中的穩(wěn)定性，但在＜70℃時固定化葡萄糖異構(gòu)酶的熱穩(wěn)定性表現(xiàn)良好且在一定范圍內(nèi)優(yōu)于水浴對照處理。

圖6 固定化葡萄糖異構(gòu)酶在微波處理下的熱穩(wěn)定性分析Fig.6 Thermal stability of immobilized glucose isomerase treated by microwave

(2)固定化葡萄糖異構(gòu)酶的操作穩(wěn)定性分析

固定化酶的操作穩(wěn)定性也是其在工業(yè)化應(yīng)用中最重要的性質(zhì)之一［20］。固定化葡萄糖異構(gòu)酶的操作穩(wěn)定性分析結(jié)果見圖7。

圖7 固定化葡萄糖異構(gòu)酶在微波處理下的操作穩(wěn)定性分析Fig.7 Operating stability of immobilized glucose isomerase treated by microwave

從圖7可以看出，固定化酶在使用次數(shù)較少時，表現(xiàn)出的較好的穩(wěn)定性;在使用6次前，微波加熱處理與水浴對照處理的酶活均保持在80%以上，在第6次使用時，兩種處理酶活分別為85.66%和91.35%。但隨著使用次數(shù)的增多，相對酶活緩慢地下降，在使用7次到15次之間時，酶活基本呈線性下降的趨勢，在使用15次后，兩種處理酶活分別為30.38%和41.66%。從總體上的變化趨勢來看，微波處理并未顯示改變固定化酶的操作穩(wěn)定性;后期隨著使用次數(shù)增多(＞10次)，微波處理固定化酶操作穩(wěn)定性降低、酶活損失較大，這可能是由于多次微波處理易導(dǎo)致酶變性引起的［21］?？偟谜f來，微波處理的固定化葡萄糖異構(gòu)酶仍具有較好的操作穩(wěn)定性，也能夠滿足實際生產(chǎn)需求，但比水浴加熱條件下操作穩(wěn)定性要略差些。

3 結(jié)論

不同微波功率對固定化葡萄糖異構(gòu)酶的活性增強(qiáng)程度不同，與水浴對照相比，在最佳微波處理條件下，酶固定化葡萄糖異構(gòu)酶活性可增加24.50%，說明適宜微波處理用于激活酶是可行的。在此活化過程中，微波處理降低固定化葡萄糖異構(gòu)酶Km，增大Vmax，但對其最適 pH和最適金屬離子濃度幾乎沒有影響;同時微波處理在一定程度上降低了固定化葡萄糖異構(gòu)酶的最適反應(yīng)溫度、最適反應(yīng)溫度范圍及高溫的熱穩(wěn)定性、操作穩(wěn)定性，但這些參數(shù)依舊較為理想，能夠滿足實際生產(chǎn)需求。

［1］ YU H，GUO Y，WU D，et al.Immobilization of glucose isomerase onto GAMM support for isomerization of glucose to fructose［J］.Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic，2011，72(1-2):73-76.

［2］ GE Y，ZHOU H，KONG W，et al.Immobilization of glucose isomerase and its application in continuous production of high fructose syrup［J］.Applied Biochemistry and Biotechnology，1998，69(3):203-215.

［3］ Tukel S S，Alagoz D.Catalytic efficiency of immobilized glucose isomerase in isomerization of glucose to fructose［J］.Food Chemistry，2008，111(3):658-662.

［4］ Bhosale S H，Rao M B，Deshpande V V.Molecular and industrial aspects of glucose isomerase［J］.Microbiological Reviews，1996，60(2):280-300.

［5］ 張甫生，李蕾，陳芳，等.非熱加工在鮮切果蔬安全品質(zhì)控制中應(yīng)用［J］.食品科學(xué)，2011，32(9):329-335.

［6］ Rawson A，Patras A，Tiwari B K，et al.Effect of thermal and non thermal processing technologies on the bioactive content of exotic fruits and their products:Review of recent advances［J］.Food Research International，2011，44(7):1 875-1 887.

［7］ YU D，WANG C，YIN Y，et al.A synergistic effect of microwave irradiation and ionic liquids on enzyme-catalyzed biodiesel production ［J］.Green Chemistry，2011，13(7):1 869-1 875.

［8］ Lukasiewicz M，Marciniak M，Osowiec A.Microwave-assisted enzymatic hydrolysis of starch［C］.Lugo:13th International Electronic Conference on Synthetic Organic Chemistry(ECSOC-13)，2009-11-30.

［9］ Roy I，Gupta M N.Non-thermal effects of microwaves on protease-catalyzed esterification and transesterification［J］.Tetrahedron，2003，59(29):5 431-5 436.

［10］ Nomanbhay S M，Hussain R，Palanisamy K.Microwave-assisted alkaline pretreatment and microwave assisted enzymatic saccharification of oil palm empty fruit bunch fiber for enhanced fermentable sugar yield［J］.Journal of Sustainable Bioenergy Systems，2013，3(1):7-17.

［11］ Porcelli M，Cacciapuoti G，F(xiàn)usco S.Non-thermal effects of microwaves on proteins:thermophilic enzymes as model system［J］.FEBS Letters，1997，402(2):102-106.

［12］ Young D D，Nichols J，Kelly R M，t al.Microwave activation of enzymatic catalysis［J］.Journal of the American Chemical Society，2008，130(31):10 048-10 049.

［13］ 胡國洲，張甫生，胡鵬，等.微波處理對葡萄糖異構(gòu)酶性質(zhì)的影響［J］.食品科學(xué)，2014，35(3):134-138.

［14］ SONG Y，Kim J，Park C，et al.Enhancement of glucose isomerase activity by pretreatment with substrates prior to immobilization［J］.Korean Journal of Chemical Engineering，2011，28(4):1 096-1 100.

［15］ Bandish R K，Hess J M，Epting K L，et al.Glucose-tofructose conversion at high temperatures with xylose(glucose)isomerases from Streptomyces murinus and two hyperthermophilic Thermotoga species［J］.Biotechnology and Bioengineering，2002，80(2):185-194.

［16］ Devece C，Rodríguez-López J N，F(xiàn)enoll L G，et al.Enzyme inactivation analysis for industrial blanching applications:comparison of microwave，conventional，and combination heat treatments on mushroom polyphenoloxidase activity［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1999，47(11):4 506-4 511.

［17］ Saha B C.Production，purification and properties of endoglucanase from a newly isolated strain of Mucor circinelloides［J］.Process Biochemistry，2004，39(12):1 871-1 876.

［18］ Saifuddin N，Raziah A Z.Enhancement of lipase enzyme activity in non-aqueous media through a rapid three phase partitioning and microwave irradiation［J］.Journal of Chemistry，2008，5(4):864-871.

［19］ Hartley B S，Hanlon N，Jackson R J，et al.Glucose isomerase:insights into protein engineering for increased thermostability［J］.Biochimica et Biophysica Acta，2000，1 543(2):294-335.

［20］ Tumturk H，Demirel G，Altinok H，et al.Immobilization of glucose isomerase in surface-modified alginate gel beads［J］.Journal of Food Biochemistry，2008，3(2):234-246.

［21］ YANG Z，NIU X，F(xiàn)ANG X.et al.Enantioselective esterification of ibuprofen under microwave irradiation［J］.Molecules，2013，18(5):5 472-5 481.