任婷月，周萬(wàn)里，張利群，畢春元，李敬龍

1(齊魯工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，山東濟(jì)南，250353)

2(山東省科學(xué)院生物研究所山東省生物傳感器重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南，250014)

葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，GOD)是一種氧化還原酶，在O2充足條件下，它能夠快速專一地催化β-D-葡萄糖為 β-D-葡萄糖酸和 H2O2［1］。它廣泛地分布于動(dòng)物、植物和微生物體內(nèi)，微生物中的主要生產(chǎn)菌株有黑曲霉和青霉［2］。由于GOD天然無(wú)毒，無(wú)副作用，因而在食品，醫(yī)藥等行業(yè)中應(yīng)用極為廣泛。在食品工業(yè)方面，它能起到去除葡萄糖，脫氧保鮮，殺菌以及葡萄糖定量分析的作用［3］，如用于啤酒、果汁、奶制品等的除氧;魚、蝦、蟹等的保鮮;蛋品加工的脫糖;面制品的增筋等。

葡萄糖氧化酶在使用和科研實(shí)驗(yàn)中都需要進(jìn)行酶活力的測(cè)定。目前，它的測(cè)定方法主要有以下幾種，一種是滴定法［4］，此法雖然簡(jiǎn)便易行，但是誤差比較大，靈敏度比較低;另外一種是連續(xù)分光光度法［5-6］，此法雖然靈敏度較高，但是測(cè)定值較低，且數(shù)據(jù)處理較復(fù)雜，成本較高;還有一種利用葡萄糖氧化酶-辣根過(guò)氧化物酶-苯胺衍生物或染料隱性體偶聯(lián)反應(yīng)體系測(cè)定［7］，這種方法非常靈敏，但也存在顯色不穩(wěn)定、短時(shí)間內(nèi)容易褪色，數(shù)據(jù)重復(fù)性不好等缺點(diǎn)，這樣就限制了葡萄糖氧化酶活力的測(cè)定在科研實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用。本研究利用生物傳感分析儀檢測(cè)葡萄糖質(zhì)量濃度［8］的工作原理，設(shè)計(jì)了葡萄糖氧化酶活力的測(cè)定方法，用過(guò)氧化氫電極檢測(cè)葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖生成H2O2的濃度從而得到葡萄糖氧化酶的活力單位［9］，用已知酶活力的葡萄糖氧化酶作標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)未知酶活力的葡萄糖氧化酶，在儀器上直接顯示酶活力單位，實(shí)現(xiàn)了葡萄糖氧化酶的快速測(cè)定，并與滴定法進(jìn)行了對(duì)比研究。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

SBA-40C型葡萄糖生物傳感分析儀，山東省科學(xué)院生物研究所;梅特勒DELTA320pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;50 mL酸式滴定管，武漢華威化工儀器有限公司。

葡萄糖氧化酶標(biāo)準(zhǔn)液，用pH 6.5磷酸緩沖液配制成100 U/mL葡萄糖氧化酶液，2～8℃保存。

無(wú)水NaH2PO4，無(wú)水Na2HPO4，配制成0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液;0.1 mol/L標(biāo)準(zhǔn)HCl溶液和0.1 mol/L的標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液，按照國(guó)標(biāo)GB/T601-2002標(biāo)定。所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水。

無(wú)水葡萄糖，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;葡萄糖氧化酶，Sigma公司;稀釋水、SBA專用緩沖液，山東省科學(xué)院生物研究所自行研制;葡萄糖氧化酶液(＞1 500 U/mL)，山東省生物傳感器重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 工作原理

SBA-40C型生物傳感分析儀是以固定化酶為關(guān)鍵元件，由微電腦控制分析過(guò)程的智能化儀表，采用固定化葡萄糖氧化酶膜復(fù)合H2O2型電極測(cè)定葡萄糖的生化反應(yīng)如下:

酶反應(yīng)生成的H2O2透過(guò)酶膜后在鉑金電極表面失去電子，鉑電極獲得電子產(chǎn)生電流信號(hào)，此電流信號(hào)與H2O2的濃度成比例，而H2O2濃度與底物濃度成線性比例關(guān)系。通過(guò)比較被測(cè)物與標(biāo)準(zhǔn)樣品產(chǎn)生的H2O2量，就可計(jì)算出被測(cè)樣品中底物的含量。我們依據(jù)生物傳感分析儀測(cè)定葡萄糖質(zhì)量濃度的工作原理，設(shè)計(jì)了葡萄糖氧化酶酶活力的測(cè)定方法。

首先，用酶液替代待測(cè)液，然后，用含一定葡萄糖量的緩沖液替代原緩沖液(葡萄糖濃度保持過(guò)量)，最后，用空酶膜替代固定化的葡萄糖氧化酶酶膜，從而構(gòu)成一個(gè)檢測(cè)酶活的系統(tǒng)。測(cè)定時(shí)，用已知活性單位的葡萄糖氧化酶溶液標(biāo)定儀器并進(jìn)行線性校正，然后將待測(cè)樣品稀釋后進(jìn)行測(cè)定，儀器顯示數(shù)值乘以稀釋倍數(shù)即為被測(cè)定樣品中的葡萄糖氧化酶活力單位。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 葡萄糖氧化酶液樣品的制備

經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)，對(duì)于過(guò)氧化氫電極法，葡萄糖氧化酶的活力范圍在0～100 U/mL時(shí)線性范圍關(guān)系較好，故將待測(cè)葡萄糖氧化酶液稀釋100倍進(jìn)行酶活的測(cè)定。

用1 000 μL移液槍準(zhǔn)確吸取待測(cè)酶液1 000 μL于80 mL小燒杯中，用少量pH 6.5的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行稀釋，然后用玻璃棒轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶中，用pH 6.5的磷酸鹽緩沖液多次洗滌小燒杯，并將洗滌后液體全部轉(zhuǎn)移到容量瓶，最后定容到100 mL，得到酶液A1，用同樣的方法得到A2，A3，做平行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 儀器定標(biāo)和樣品測(cè)定

采用含葡萄糖1%，pH=6.5的磷酸鹽緩沖液作為流動(dòng)相，充滿傳感器的管道和反應(yīng)池，采用100 U/mL葡萄糖氧化酶溶液作為標(biāo)準(zhǔn)液。開機(jī)后，用微量進(jìn)樣器取25 μL葡萄糖氧化酶標(biāo)準(zhǔn)液迅速注入反應(yīng)池內(nèi)，20s后儀器顯示酶相對(duì)活性并自動(dòng)清洗，清洗結(jié)束后再取25 μL上述標(biāo)準(zhǔn)液注入反應(yīng)池，如果2次測(cè)量誤差不超過(guò)2%，則提示定標(biāo)通過(guò)，自動(dòng)清洗后即可測(cè)定樣品，進(jìn)樣量為25 μL，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。

葡萄糖氧化酶活力=樣品測(cè)定值×稀釋倍數(shù)

1.4 滴定法

對(duì)于滴定法，葡萄糖氧化酶的活力范圍在1.125～5.321 U/mL時(shí)線性范圍關(guān)系較好［10］，故將待測(cè)葡萄糖氧化酶液稀釋1 000倍進(jìn)行酶活力的測(cè)定。

葡萄糖氧化酶液樣品的制備:用100 μL移液槍準(zhǔn)確吸取待測(cè)酶液100 μL于80 mL小燒杯中，用少量pH 6.5的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行稀釋，然后用玻璃棒轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶中，用pH 6.5的磷酸鹽緩沖液多次洗滌燒杯，并將洗滌液全部轉(zhuǎn)移到容量瓶，最后定容到100 mL，得到酶液B1，用同樣的方法得到B2，B3，做平行實(shí)驗(yàn)。

滴定法具體操作步驟按照文獻(xiàn)［10］進(jìn)行，每個(gè)酶液樣品平行測(cè)定3次，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳pH實(shí)驗(yàn)

分別采用 pH 為 4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5的磷酸緩沖液作為流動(dòng)相進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，不同pH值的磷酸鹽緩沖液對(duì)葡萄糖氧化酶的活力測(cè)定的影響見(jiàn)圖1。結(jié)果表明:pH 6.5時(shí)的響應(yīng)值最高，所以選取pH 6.5的緩沖液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

圖1 pH對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響Fig.1 The effect of pH on the determination

2.2 線性實(shí)驗(yàn)

首先，按照1.3.2的方法用25 μL，100 U/mL葡萄糖氧化酶標(biāo)準(zhǔn)液標(biāo)定儀器，定標(biāo)通過(guò)后，再取12.5 μL標(biāo)準(zhǔn)液注入反應(yīng)池，待反應(yīng)結(jié)束后，按動(dòng)“線性校正”鍵，則儀器自動(dòng)完成線性校正。然后，分別對(duì)0、20、40、60、80、100 U/mL 葡萄糖氧化酶標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖2。

以濃度作為X值，響應(yīng)值作為Y值進(jìn)行回歸分析，得線性回歸方程:Y=1.001 4X+0.095 2，r=0.999 1。其中X為濃度，Y為響應(yīng)值，r為相關(guān)系數(shù)。結(jié)果表明:用本系統(tǒng)測(cè)定葡萄糖氧化酶活力時(shí)，進(jìn)行線性校正后，進(jìn)樣量在0～100 U/mL之間表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。

圖2 線性實(shí)驗(yàn)Fig.2 Test of lineary

2.3 精密度實(shí)驗(yàn)

連續(xù)10次對(duì)100 U/mL的葡萄糖氧化酶樣品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明:精密度性實(shí)驗(yàn)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.63%，表明該檢測(cè)葡萄糖氧化酶活力的方法有較好的精確性。

2.4 回收率實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)備6份10 U/mL的葡萄糖氧化酶溶液，分別加入不同活力單位的葡萄糖氧化酶標(biāo)準(zhǔn)品，作回收率實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明，回收率在97.9% ～101.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.51%，表明此方法檢測(cè)葡萄糖氧化酶活力具有良好的準(zhǔn)確性。

表1 精密度實(shí)驗(yàn)Table 1 Test for precision

表2 回收率實(shí)驗(yàn)Table 2 Test for recovery

2.5 對(duì)比試驗(yàn)

分別采用過(guò)氧化氫電極法與滴定法對(duì)實(shí)驗(yàn)室保藏葡萄糖氧化酶液進(jìn)行測(cè)定。

2.5.1 過(guò)氧化氫電極法

將葡萄糖氧化酶液稀釋100倍之后，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 過(guò)氧化氫電極法對(duì)葡萄糖氧化酶活的測(cè)定Table 3 The determination of glucose oxidase activity by hydrogen peroxide electrode method

2.5.2 滴定法

將葡萄糖氧化酶液稀釋1 000倍之后，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 滴定法對(duì)葡萄糖氧化酶活的測(cè)定Table 4 The determination of glucose oxidase activity by titration

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:由過(guò)氧化氫電極法所測(cè)的葡萄糖氧化酶活力為4 100 U/mL，由滴定法所測(cè)的葡萄糖氧化酶活力為4 111 U/mL，2種方法對(duì)葡萄糖氧化酶活力的測(cè)定結(jié)果相差不大，在誤差允許的范圍內(nèi)。

3 結(jié)論

本研究利用SBA-40C型生物傳感分析儀建立了一種葡萄糖氧化酶活力的快速測(cè)定方法，通過(guò)過(guò)氧化氫電極檢測(cè)葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖生成H2O2的濃度從而得到葡萄糖氧化酶的活力單位，并采用該方法和滴定法對(duì)山東省生物傳感器重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏的葡萄糖氧化酶液進(jìn)行了酶活測(cè)定。由結(jié)果可以看出:該檢測(cè)系統(tǒng)的最佳反應(yīng)pH為6.5，測(cè)定時(shí)間20 s，操作周期小于60 s，連續(xù)10次測(cè)定RSD值為0.63%，0～100 U/mL的范圍內(nèi)線性良好，r=0.999 1，并且該方法與滴定法的檢測(cè)結(jié)果相差不大，在誤差允許的范圍內(nèi)。滴定法是目前測(cè)定葡萄糖氧化酶活力的主要方法，但該方法存在操作步驟繁瑣，靈敏度較低等缺點(diǎn)，過(guò)氧化氫電極法快速，準(zhǔn)確，專一性好，操作簡(jiǎn)單，且精密度較高，是一種高效的分析方法。結(jié)果表明:用過(guò)氧化氫電極測(cè)定葡萄糖氧化酶的活力是一種理想的快速測(cè)定方法。

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