杜宏福，董愛靜，聶志強，王敏，鄭宇，林楓

(天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津，300457)

食醋是國際上消費量最大的酸性調(diào)味品，山西老陳醋是我國著名傳統(tǒng)食醋之一，以其“酸醇厚、味清香、回味綿、質(zhì)濃稠、色紫檀和久貯不變質(zhì)”的特色深受廣大消費者喜愛。山西老陳醋的酸度較高，但酸味柔和，無刺激感，口感獨特，其酸味的主體成分是有機酸。豐富多樣的有機酸不僅賦予了老陳醋獨特的口感，同時也是老陳醋主要的風(fēng)味物質(zhì)組成，其組成和含量與食醋的質(zhì)量密切相關(guān)。山西老陳醋中的有機酸以醋酸和乳酸為主，此外還有丙酮酸、檸檬酸、蘋果酸、草酰乙酸、琥珀酸等［1］。呂艷歌等［2］對山西老陳醋發(fā)酵過程中有機酸的變化分析表明，乙酸、乳酸以及總有機酸的含量變化趨勢較明顯，草酸、酒石酸、丙酮酸和富馬酸含量較低。山西老陳醋采用固態(tài)醋酸發(fā)酵工藝，以高粱、麩皮、谷糠等為主要原料，加入大曲起始發(fā)酵，發(fā)酵過程中微生物不斷繁殖、富集，從而完成大分子糖質(zhì)原料的糖化、酒化、醋化與酯化過程，過程中復(fù)雜的微生物群落代謝產(chǎn)生了大量的有機酸［3］。因此，對發(fā)酵過程中的有機酸進行分析檢測不僅有助于闡明山西老陳醋發(fā)酵過程，也是進一步保障產(chǎn)品品質(zhì)的重要手段。

傳統(tǒng)食醋固態(tài)釀造過程中有機酸的控制和分析通常依靠經(jīng)驗，然而經(jīng)驗控制法缺乏客觀的評價標準，容易受到主觀因素的影響，常導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定。近年來，HPLC［4，5］、GC［6］、GC-MS［7］等分析方法被廣泛用于食醋中有機酸的分析，這些方法雖然精確、重復(fù)性好，但對設(shè)備和操作要求較高，樣品處理步驟多，并且檢測時間長，難以實現(xiàn)快速、實時檢測。電子舌是近年來發(fā)展起來的用于食品分析、識別和檢測的分析儀器，它使用一種類似于生物系統(tǒng)的材料作為傳感器的敏感膜，當(dāng)類脂薄膜的一側(cè)與味覺物質(zhì)接觸時，膜電勢發(fā)生變化，從而產(chǎn)生響應(yīng)信號，對樣品進行量化分析。電子舌技術(shù)不僅具有較高的靈敏度、可靠性和重復(fù)性，并且還具有檢測時間短，樣品處理簡單等優(yōu)點，在飲料、酒類等食品的區(qū)分與品質(zhì)檢測、農(nóng)產(chǎn)品識別與分級等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用［8-10］。Lvova［11］等研究表明，電子舌可以很好地區(qū)分紅茶、綠茶和咖啡，并能預(yù)測綠茶中咖啡堿、單寧酸、蔗糖和葡糖糖、L-精氨酸和茶氨酸的含量。魯小利等［12］利用電子舌對黃酒中酒精度、氨基酸、揮發(fā)酯、總糖、總酸和固形物、pH 值建立了預(yù)測模型，張璟琳等［13］，張浩玉等［14］，黃星奕等［15］分別從不同方面利用電子舌對食醋進行了分析，但利用電子舌對山西老陳醋發(fā)酵過程中樣品進行識別及某種特定有機酸的定量分析方面的研究還未有報道。

本論文以山西老陳醋固態(tài)醋酸發(fā)酵過程中不同發(fā)酵階段的樣品為研究對象，首先利用HPLC對山西老陳醋發(fā)酵過程中的有機酸變化規(guī)律進行了定量分析，隨后采用電子舌對醋酸發(fā)酵過程中不同時期的樣品進行了檢測并對其中主要有機酸的濃度進行了預(yù)測，建立了食醋固態(tài)醋酸發(fā)酵過程中有機酸的快速模擬檢測方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

山西老陳醋醋酸發(fā)酵周期約為9 d，根據(jù)山西老陳醋醋酸發(fā)酵的周期規(guī)律，從發(fā)酵車間分別采集3個不同批次的醋酸發(fā)酵階段第0、1、3、5、7天的醋醅各500 g，取樣前翻醅均勻，取樣深度距表面30 cm，依次編號為 0-1、0-2、0-3、1-1、1-2、1-3、3-1、3-2、3-3、5-1、5-2、5-3、7-1、7-2、7-3，裝入無菌自封袋，置入冰盒中立即運回實驗室，于-80℃保存。

1.2 主要儀器和試劑

高效液相色譜儀(Aglient 1200)，安捷倫科技公司;電子舌(Smartongue)，上海瑞芬科學(xué)儀器有限公司;檸檬酸、酒石酸、蘋果酸、琥珀酸、乳酸和乙酸等標準品(色譜純)，Sigma-Aldrich公司;濃硫酸(98%)，色譜純;NaOH，分析純。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

分別取10 g醋醅樣品加入去離子水定容至100 mL，搖床轉(zhuǎn)速 120 r/min、25℃條件下振蕩 2 h，10 000 r/min離心取上清液，-4℃保存待測，HPLC檢測前用0.45 μm水膜過濾。

1.3.2 總酸的測定

采用NaOH滴定法測定，結(jié)果以乙酸計［2］。

1.3.3 水分含量的測定

采用烘干法［2］。

1.3.4 有機酸HPLC檢測

配制6種有機酸標準溶液，并分別制作標準曲線，根據(jù)有機酸標準品的數(shù)據(jù)計算樣品中有機酸的組成和濃度。

HPLC 檢測條件如下［4］:色譜柱 Aminex HPX-87H 300 mm×7.8 mm;流動相 0.005 moL/mL H2SO4;流速0.6 mL/min;進樣量20 μL;紫外檢測器波長215 nm;柱溫30℃。

1.3.5 電子舌分析

采用Smartongue電子舌檢測系統(tǒng)，檢測探頭由特定的多通道交互敏感的傳感器陣列構(gòu)成，工作電極為:鉑電極、金電極、鈀電極、鈦電極、鎢電極和銀電極，參比電極為鉑柱電極。電子舌系統(tǒng)工作溫度控制為25℃。分別取50 mL經(jīng)處理的醋醅樣品進行分析，蒸餾水作為校準液。數(shù)據(jù)采集前，電子舌系統(tǒng)經(jīng)過自檢、診斷和矯正等過程，以確保電子舌傳感器響應(yīng)信號的可靠性和穩(wěn)定性。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理方法

主成分分析(principal component analysis，PCA)是將多個變量通過線性變換以選出較少個數(shù)重要變量的一種多元統(tǒng)計方法。它在保留原始數(shù)據(jù)信息的基礎(chǔ)上將多指標數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成少數(shù)幾個主成分，起到降維和簡化問題的作用。每個樣本經(jīng)Smartongue電子舌檢測獲得160個原始數(shù)據(jù)，利用SPSS Statistics(v 19.0)軟件對原始數(shù)據(jù)進行主成分分析，得到主成分散點圖，圖中的每個點代表一個樣品，點之間的距離代表樣品之間差異性的大小。

采用minitab statistical software(v16.0)軟件對發(fā)酵過程中的樣品進行聚類分析(cluster analysis，CA)。將PCA分析提取的主成分值作為變量計算樣品之間的歐氏距離，并且采用最短距離法進行類與類的合并，得到聚類分析樹形圖。

由于電子舌傳感器的響應(yīng)值和所測液體的成分之間關(guān)系復(fù)雜，很難用明確的數(shù)學(xué)關(guān)系表示，而BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)具有很強的學(xué)習(xí)系統(tǒng)，能夠?qū)崿F(xiàn)輸入和輸出之間的高度非線性映射，因此研究利用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建立電子舌信息與發(fā)酵過程中的特征有機酸的關(guān)系。每個發(fā)酵階段選取2個樣品作為訓(xùn)練網(wǎng)絡(luò)的樣本，其他的作為測試樣本。PCA處理獲得的主成分值作為網(wǎng)絡(luò)輸入，有機酸作為網(wǎng)絡(luò)輸出，利用MATLAB(v 7.0.1)軟件中的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模塊訓(xùn)練網(wǎng)絡(luò)并對訓(xùn)練好的網(wǎng)絡(luò)進行測試。

2 結(jié)果與分析

2.1 醋酸發(fā)酵過程中有機酸分析

利用HPLC對山西老陳醋醋酸發(fā)酵過程中的主要有機酸進行了分析，同時采用滴定法對總酸進行了檢測。經(jīng)測定發(fā)酵過程中醋醅水分含量基本維持在60%左右，差異不顯著，文中數(shù)據(jù)均采用濕醅計算，結(jié)果見表1。

從表1可以看出，在醋酸發(fā)酵過程中，總酸逐漸增加，其中乙酸和乳酸的含量占總酸的60%以上，遠高于其他有機酸，是醋醅中的主要有機酸，其次是檸檬酸和琥珀酸。醋酸發(fā)酵初期，乳酸含量很高，占總酸的67%左右，主要來源于厭氧的酒精發(fā)酵階段，隨后呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，在發(fā)酵后期由于乙醇和葡糖糖耗盡，乳酸可能作為碳源被微生物利用［16］，從而造成乳酸的減少。隨著發(fā)酵的進行，醋酸菌數(shù)量逐漸增加［3］，不斷將乙醇轉(zhuǎn)化為乙酸，乙酸呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢。琥珀酸是檢測到的第三大有機酸，但其從第5天才開始出現(xiàn)，檸檬酸、酒石酸、蘋果酸的變化不規(guī)律，具有一定的波動性。

表1 醋酸發(fā)酵過程中各種有機酸含量Table 1 The content of organic acids during the acetic acid fermentation process

通過HPLC檢測發(fā)現(xiàn)，山西老陳醋醋酸發(fā)酵過程中乙酸和乳酸是主要的特征有機酸，其變化具有一定的規(guī)律性，發(fā)酵過程中對乙酸和乳酸的含量進行檢測，有利于對醋酸發(fā)酵進程和食醋質(zhì)量品質(zhì)的監(jiān)控。

2.2 電子舌對醋酸發(fā)酵過程的分析

2.2.1 數(shù)據(jù)處理和特征提取

利用電子舌對5個階段的醋醅樣品進行分析，每次測量獲得原始數(shù)據(jù)160個，代表了醋醅樣品的物質(zhì)組成信息。利用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行PCA分析，以達到簡化數(shù)據(jù)的目的，表2列出了原始數(shù)據(jù)的主成分特征值及貢獻率。PCA分析顯示，醋醅樣品前14個主成分即可綜合原始數(shù)據(jù)100%的信息，說明取前14個主成分所構(gòu)成的特征數(shù)據(jù)就能夠精確的擬合原始數(shù)據(jù)，這樣就極大的壓縮了原始數(shù)據(jù)，便于進行統(tǒng)計分析。

表2 PCA分析主成分的特征值及貢獻率Table 2 Characteristic value and the rate of contribution by PCA

2.2.2 醋醅樣品的聚類分析和PCA分析

采用minitab軟件對發(fā)酵過程中的樣品進行了聚類分析，結(jié)果如圖1。從圖1中的聚類樹形圖來看，醋醅樣品明顯分為2大類，0天的樣品分為一類，1、3、5、7天的樣品分為一類。一般認為相似值高于60%的樣品，具有較好的相似性，兩類樣品的相似性低于60%，說明0天的樣品與其他的樣品差異性較大。1、3、5、7天樣品之間的相似性在60% ～70%之間，發(fā)酵過程中樣品的品質(zhì)較為接近。隨著發(fā)酵的進行，代謝物不斷累積，樣品的品質(zhì)隨之變化，聚類分析圖中表現(xiàn)出發(fā)酵時間接近的樣品之間相似性也越高的規(guī)律。聚類分析不僅揭示了發(fā)酵過程中樣品之間的聚類關(guān)系，而且定量地描述了樣品之間的差異程度。

圖1 聚類分析樹形圖Fig.1 Dendrogram of cluster analysis

進一步，采用主成分得分作圖(圖2)，觀察電子舌對發(fā)酵過程中醋醅樣品的區(qū)分規(guī)律。圖2中樣品之間的距離代表了它們差異性的大小。從圖2可看出，主成分因子1(F1)的貢獻率為42.63%，主成分因子2(F2)的貢獻率為18.32%，前兩個主成分貢獻率達到60.95%，代表了電子舌檢測的主要信息。

圖2 醋醅樣品的主成分分析Fig.2 Principal component analysis of vinegar culture

從圖2中可看出，不同發(fā)酵時間的樣品在主成分分析圖中分布的區(qū)域不同:0天的樣品聚集于F1的負半軸、F2的正半軸區(qū)域;1、3、5天的樣品聚集于F2的負半軸區(qū)域;7天的樣品聚集于F1的正半軸、F2的正半軸區(qū)域，說明電子舌能夠?qū)Σ煌l(fā)酵時間的醋醅樣品進行很好的區(qū)分。山西老陳醋在酒精發(fā)酵完成后，加入麩皮等原料制成醋醅，并接入上一批的醋醅(接火)開始醋酸發(fā)酵，圖2顯示第0天的醋醅與其它時間的樣品距離較遠，具有很大的差異性，這與聚類分析(圖1)的結(jié)果相符合。隨著醋酸發(fā)酵的進行，醋醅中的醋酸菌、乳酸菌等微生物不斷生長，產(chǎn)生并積累了豐富的代謝產(chǎn)物［3］，電子舌的檢測數(shù)據(jù)反映在圖2中，即表現(xiàn)為發(fā)酵第1、3、5、7天的樣品呈現(xiàn)從左至右，自下而上的變化規(guī)律。同時可發(fā)現(xiàn)圖2中主成分F1方向梯度變化與乙酸含量變化呈正相關(guān)的關(guān)系，而F2方向梯度變化與乳酸含量變化呈負相關(guān)的關(guān)系，主成分F1和F2分別代表了乙酸和乳酸含量的主要信息。通過統(tǒng)計分析方法可進一步的建立電子舌數(shù)字化信息與發(fā)酵過程中的特征有機酸乙酸和乳酸的關(guān)系。

2.3 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)定量分析

研究建立了一個3層(輸入層、隱含層和輸出層)的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)如圖3。電子舌信息經(jīng)PCA處理得到的14個主成分值作為網(wǎng)絡(luò)輸入，乙酸和乳酸值分別作為網(wǎng)絡(luò)輸出。經(jīng)多次實驗選擇乙酸的網(wǎng)絡(luò)隱含層單元數(shù)為8，乳酸的網(wǎng)絡(luò)隱含層單元數(shù)為7，最小訓(xùn)練速率為0.1，動態(tài)參數(shù)為0.6，允許誤差為0.000 1，最大訓(xùn)練次數(shù)為1 000。網(wǎng)絡(luò)經(jīng)訓(xùn)練樣本訓(xùn)練后，對測試樣本進行預(yù)測，網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練與測試的結(jié)果見表3。

圖3 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型Fig.3 Neural network models

表3 乙酸和乳酸神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測結(jié)果Table 3 Results of quantitative prediction for acetic acid and lactic acid

BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)得到的預(yù)測值與實測值的關(guān)系圖見圖4。圖中的橫坐標表示乙酸或乳酸的實測值，縱坐標表示模型的預(yù)測值。圖4中的擬合數(shù)據(jù)點越靠近y=x曲線，模型的準確度越高［15］，從圖4可看出乙酸和乳酸的數(shù)據(jù)點均分布于y=x兩側(cè)附近，說明乙酸和乳酸的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型效果較好。進一步采用預(yù)測值和實測值的相關(guān)系數(shù)作為評價BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的指標，相關(guān)系數(shù)取值在0和1之間，值越接近1，相關(guān)程度越顯著［17］。從表3可以看出，該模型訓(xùn)練樣本預(yù)測值相對誤差均小于5%，經(jīng)計算乙酸和乳酸的預(yù)測值與實測值之間的相關(guān)系數(shù)分別達到0.984 9和0.972 4，預(yù)測均方根誤差［17］分別為24.6和21.2 mg/100 g，說明乙酸和乳酸的網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練模型精度較高。從網(wǎng)絡(luò)測試的結(jié)果來看，1 d樣本的乙酸含量預(yù)測誤差較大，相對誤差為9.17%，其他樣品預(yù)測值相對誤差均小于5%，乙酸和乳酸的預(yù)測值和實測值相關(guān)系數(shù)分別達到0.961 5和0.994 2，預(yù)測均方根誤差分別為54.4 mg/100 g和59.0 mg/100 g，整體來看BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型對乙酸和乳酸定量預(yù)測結(jié)果較好，可利用電子舌對醋酸發(fā)酵過程中乙酸和乳酸的含量進行預(yù)測。目前該模型僅適用于同一取樣車間，采用相同工藝進行連續(xù)生產(chǎn)的樣品，模型的精度取決于建立模型的樣本數(shù)量，因此進一步地可通過增加樣本量及取樣范圍，提高模型預(yù)測的精度，擴大模型的適用范圍。

圖4 乙酸和乳酸的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測值和實測值關(guān)系圖Fig.4 Correspondence of acetic acid and lactic acid between prediction values by BP NN and the observed values

3 結(jié)論

采用HPLC方法對山西老陳醋發(fā)酵不同階段醋酸中的有機酸進行了分析，發(fā)現(xiàn)乙酸和乳酸是醋酸發(fā)酵階段的主要有機酸，其中乙酸含量隨醋酸發(fā)酵的進行逐漸增加，而乳酸的含量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。利用電子舌對不同發(fā)酵階段的醋醅樣品進行了檢測，通過PCA分析和聚類分析發(fā)現(xiàn)電子舌能夠?qū)Σ煌l(fā)酵時間的醋醅樣品進行區(qū)分，并且可以對不同樣品之間的差異程度進行定量描述。進一步，采用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型建立了電子舌檢測數(shù)據(jù)與發(fā)酵過程中乙酸和乳酸的定量關(guān)系，實現(xiàn)了對醋酸發(fā)酵過程中乙酸和乳酸的定量預(yù)測。

電子舌檢測樣品僅需1～3 min，而常規(guī)的HPLC方法需約30 min，采用電子舌檢測大大縮短了檢測時間，并且電子舌便于攜帶，樣品處理簡單。電子舌技術(shù)為食醋規(guī)?；a(chǎn)提供了現(xiàn)場快速分析的智能質(zhì)量監(jiān)控手段，有利于企業(yè)食醋生產(chǎn)的優(yōu)化控制和產(chǎn)品質(zhì)量的提升。

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