張斌，郁聽，栗磊，孟祥河

1(浙江工業(yè)大學海洋學院，浙江杭州，310014)2(杭州博士達油脂有限公司，浙江杭州，311103)

植物甾醇(plant sterol，PS)又稱植物固醇，它是一種結構與膽固醇類似但具有多重生理活性的三萜烯。早在19世紀50年代，人們就發(fā)現(xiàn)了PS的降膽固醇功效，之后又通過大量的動物和臨床試驗來研究PS的每日最適攝入量，歐洲食品安全局推薦每日應攝入PS 1.5～3 g，這樣可降低人體內7% ～11.3%的低密度脂蛋白膽固醇。PS主要來自于植物油的不皂化物，需經(jīng)過分離提取才能富集到高純度的產物，而且PS的水溶性和油溶性均較差，這會限制其在人體內的吸收率。因此，本文就PS上述方面問題總結了近些年國內外的研究進展，并對在食品加工貯藏時產生的植物甾醇氧化產物(plant sterol oxidation products，POPs)及其食用安全性問題展開較全面的綜述。

1 來源

PS主要以自由醇結構、脂肪酸酯、甾基糖苷及其?；锏刃问酱嬖谟谧匀唤?。PS在食用油中以游離和酯化形式為主，這些油的來源包括堅果、谷物、豆類和植物種子等［1-2］。當然，從蛋黃、哺乳動物的肝臟和甲殼類動物等非植物膳食原料中也可獲取少量PS［3］。迄今為止報道的PS主要來源有:(1)植物油提取工藝副產物-脫臭餾出物(deodorizer distillate，DD)［4-5］;(2)工業(yè)生產的下腳料浮油［6-7］;(3)釀酒行業(yè)中的發(fā)酵廢棄物［8］。

2 分子結構和生理功效

PS是以環(huán)戊烷多氫菲為主要骨架的3-羥基化合物(圖1)，一般在C-17位上連有由8～10個碳原子組成的側鏈，根據(jù)C-5位上有無雙鍵分為甾醇和甾烷醇。常見的PS有豆甾醇、β-谷甾醇、菜油甾醇和菜籽甾醇，它們主要的結構區(qū)別在于支鏈大小和雙鍵數(shù)目。

圖1 幾種主要代表性甾醇與膽固醇結構圖Fig.1 Structure figures of several main representative sterols and cholesterol

PS C-3位上的OH和C-5位上的雙鍵決定其具有多重生理功效。目前人們研究最多的是PS的降膽固醇功效，而且普遍認為PS能與膽固醇競爭溶解于小腸內腔的膽汁酸微膠束，減少微膠束中膽固醇的含量，使之不能運送到達小腸微絨毛的吸收部位。而Liang等的研究結果表明，PS通過調控膽固醇代謝轉運脂蛋白和相關酶的表達也能減少膽固醇在人體內吸收［9-10］。此外，PS 還有抗炎、退熱、美容、抗癌、促進動物生長等生理功效。近幾年的研究熱點在減肥和抗氧化兩方面，如Furlan［11］等在動物喂養(yǎng)試驗中發(fā)現(xiàn)，小鼠若喂以含2%PS的高脂膳食(其中含有12% 的蛋白質和35% 的脂肪)，持續(xù)8周小鼠體重較對照組明顯減輕。正因為PS這么多的生理功效，因此早已被廣泛應用于食品、藥品和化妝品等多個領域［12-14］。

3 PS分離提取技術

PS部分以酯化形式存在于原材料中，所以提取前一般先進行水解使之全部轉化成游離PS。水解分為高溫高壓水解和堿水解，后者因條件溫和，且水解皂化一起進行，因此使用較普遍。目前PS的提取方法根據(jù)其來源分:(1)植物油DD中PS提取工藝［15-16］(如圖2所示)。

a途徑適用于游離脂肪酸、甘油三酯和生育酚含量較多的DD，具體是先通過真空蒸餾或皂化反應分離出游離脂肪酸，此時剩余物質主要包括PS、生育酚、烴類、甘油一酯、甘油二酯和甘油三酯，其中PS與苯甲酸酐酯化生成甾醇酯(sterol ester，SE)，再短程蒸餾去除生育酚，最后轉酯化反應后冷卻分離得到PS晶體。含游離脂肪酸和生育酚較少的DD則采用b途徑，由皂化反應得到的未皂化物冷卻結晶分離得到PS粗制品;(2)浮油中PS提取工藝［17］(如圖3所示)。由正己烷萃取得到的未皂化部分經(jīng)熱水沖洗、有機相濃縮、蒸餾等步驟分別去除無機鹽、溶劑和輕餾分等得到PS晶體;(3)天然油料作物中提取PS:該提取工藝與浮油中PS的提取過程基本相似，只是在原料浸提和萃取時結合了微波輔助萃取、超臨界CO2萃取或固相萃取等新提取技術［18-20］，再通過高速逆流色譜法等技術分離純化［21］，PS的結構和純度分析一般采用氣相色譜(gas chromatography，GC)［22-24］。

圖2 脫臭餾出物中甾醇的提取工藝Fig.2 Extraction process of sterol in deodorizer distillate

圖3 浮油中甾醇的提取工藝Fig.3 Extraction process of sterol in tall oil

4 溶解性的改性研究

天然的PS熔點高(130～180℃)，在水中不溶，油溶性也非常低且有白堊味，這些性狀是PS應用的瓶頸。因此，近年來國內外研究人員嘗試通過PS溶解性改性以獲得更好的應用。

4.1 PS水溶性研究

國內外對于PS水溶性研究報道較少。早期人們主要通過添加硬脂酸鈉、卵磷脂和單甘酯等單一或復合乳化劑以改善PS在水中的分散性，或再制成微膠囊應用于全脂到無脂等多種產品［25-26］。但是乳化方法只是提高了PS在水溶性食品中的分散性和穩(wěn)定性，其水溶性并未得到實質改善。受到環(huán)糊精與黃酮類藥物包合應用的啟發(fā)，張娟聰?shù)龋?7］嘗試以正丁醇為溶劑，PS濃度2%，β-環(huán)糊精與PS的摩爾比為4∶1，40℃，中等速度攪拌下將β-環(huán)糊精與PS包合12 h，PS的包合率可達90%，且水溶性得到明顯改善。之后呂曉玲［28］和周陽［29］還對羥丙基-β-環(huán)糊精包合效果進行了評價，發(fā)現(xiàn)包合物相比未經(jīng)包合的PS在水中的溶解度提高了200倍以上，并通過動物實驗證實包合產物并不影響原PS的降血脂功效。

4.2 PS油溶性研究

油溶改性主要通過PS和脂肪酸酯化或者與脂肪酸甲酯酯交換合成植物甾醇酯(sterol esters，SE)，若利用長鏈脂肪酸與PS反應還可獲得更高的生物活性，因此該產品可廣泛應用在含脂食品中。

酯化合成根據(jù)所用催化劑分為化學法和酶法。早期人們采用甲醇鈉催化化學法合成SE，但容易生成一些副產物(如氧化甾醇和脫水甾醇)，且得到的SE純度不高。因此Meng等［30］研究硅鎢酸作為酯化反應催化劑，以獲得高產量高純度的SE，該研究證實硅鎢酸經(jīng)過六次連續(xù)使用后，仍然有比較強的催化能力，基本符合工業(yè)化生產要求。Valange等［31］發(fā)現(xiàn)，La2O3表面碳酸鹽堿性越小，SE酯化率越高，同時還能有效抑制β-谷甾醇側鏈的脫水反應。酶法合成反應條件溫和、專一性強、副反應較少、產物質量好并易于純化分離，所以近幾年人們在酶法合成上進行了大量研究。Zheng等［32］利用假絲酵母固定化脂肪酶合成亞麻酸甾醇酯，該固定化酶不僅對反應pH和溫度有較強抗性，而且在55℃、醇酸摩爾比1.5∶1、反應6 h條件下，酯化率高達95.3% 。Hellner等［33］在無溶劑體系下以PS、辛酸和葵花油為原料酶法一步合成結構脂質和SE，酯化率和甘油三酯轉化分別為92.1%和44.1%。季國志等［34］將SE與α-亞麻酸復配并成功應用于乳制品?？梢?，隨著研究的深入，人們在SE合成反應上必定向營養(yǎng)功能最大化方向發(fā)展。

5 PS氧化物(POPs)

天然PS在光、熱、O2或酶等作用下，會發(fā)生自身氧化或者酶促氧化形成POPs。POPs種類繁多，主要分為主環(huán)氧化物和側鏈氧化物。自身氧化一般生成包含羥基(—OH)、酮基 keto-(=O)、環(huán)氧基(epoxy-)和三羥基(triol-)等結構的主環(huán)氧化物，而活體內的酶促氧化則生成側鏈氧化物，大都包含20 OH—、25 OH—、26 OH—、29 OH—等結構(如圖4所示)。PS氧化速度和氧化產物因氧化條件不同而各異，如Rudzińska等［35］將含有 PS的黃油分別在 4℃和 20℃ 儲藏18周，儲藏結束時發(fā)現(xiàn)20℃下PS總量下降了30%，7-OH氧化物含量卻上升了3倍，epoxy-氧化物在第 6周達到最大值，隨后又不斷下降。關于POPs的分析，一般采用 GC-MS。Menéndez-Carre?o等［36］則認為 GC×GC分離技術有助于更好地對POPs進行選擇性分析，研究還證實了最易生成的POPs主要是7-OH、7-keto和5，6-epoxy氧化物。

圖4 POPs的一般形成過程和結構Fig.4 General forming process and structure of POPs

6 安全性

盡管FDA和歐盟都已批準PS可用于降膽固醇食品中，但是天然PS或由于加工不當產生的POPs在人體內的實際生理活性研究和安全性仍然是目前的研究熱點。

6.1 天然PS和SE

一般認為，天然PS是安全性較高的新型功能食品添加劑。但Katan等［37］發(fā)現(xiàn)，PS的攝入會降低血液中脂溶性維生素的水平，可能是由于前者可減少血液中的脂溶性維生素載體-脂蛋白的含量所致，但這可以通過攝入富含對應營養(yǎng)成分的食物加以補充。

植物固醇血癥(又稱谷固醇血癥)是由于ABCG5和ABCG8(調控腸道內PS吸收的轉運蛋白)的突變使PS在膽汁中代謝出現(xiàn)障礙而導致血液中PS水平過高的一種罕見的遺傳性脂質代謝疾病，患有該代謝疾病的個體過多攝入PS有可能得黃瘤和早發(fā)性冠心?。?8］，至于 PS對兒童和孕婦的影響還有待考究［39］?？偟膩碚f，天然PS具有較高的食用安全性。

6.2 POPs

因為POPs與膽固醇氧化產物(cholesterol oxidation products，COPs)在結構上類似，所以POPs的安全性問題也備受關注。到目前為止，POPs的生理活性和安全性研究包括:

6.2.1 降膽固醇功效

最新研究證明，膳食中摻入一定量豆甾醇氧化物會阻礙低密度脂蛋白受體(LDLR:跟血液中低密度膽固醇的去除有關)和HMG-CoA還原酶(膽固醇合成速率限制酶)的表達［10］，而且豆甾醇氧化物無法激活LXRα(LXRα 是減少膽固醇吸收的靶向受體)［40］，因此大多POPs不再具備降膽固醇功效。

6.2.2 動脈粥樣硬化和炎癥反應

COPs目前已被證實可促使動脈粥樣硬化，引起炎癥反應，所以人們就POPs展開了類似的毒性試驗。Yang等［41］發(fā)現(xiàn)，β-谷甾醇氧化混合物可減緩血管舒張，從而損傷主動脈的功能性，這可能會導致動脈粥樣硬化。Vejux等［42］則證實了7-keto-谷甾醇可減少單核白細胞(U937細胞)中白介素-8的分泌，當7-keto-谷甾醇濃度為60 μM時，還可促進人體結腸癌細胞(Caco-2)中促炎性細胞因子、腫瘤壞死因子TNF-α和白介素-8的分泌，而TNF-α的增加直接影響腸上皮細胞的完整性?？梢娔承㏄OPs也可促使動脈粥樣硬化，引起炎癥反應，甚至致癌。

6.2.3 性激素分泌

不同POPs對雌性激素影響不同?；旌螾OPs作用于乳腺癌細胞MCF-7刺激雌激素產生，而單純的7β-OH-豆甾醇氧化物作用則出現(xiàn)了抗雌激素反應［43］，van den Heuvel等［44］卻發(fā)現(xiàn)，谷甾醇氧化物和豆甾醇氧化物的混合物僅影響雄性激素分泌而對雌性激素沒有影響，所以POPs對于性激素的影響可能要對不同種類的氧化物分別研究才能定論。

6.2.4 細胞毒性

POPs的細胞毒性是目前研究和報道較多的。Adcox等［45］首先提出高濃度下POPs具有細胞毒性，甚至引起細胞凋亡，高俊蘭［46］也對POPs的細胞毒性進行了初探，發(fā)現(xiàn)其與COPs有類似的毒性，但毒性遠低于 COPs。具體研究［47-49］表明，β-谷甾醇氧化物細胞凋亡的水平最高，在U937細胞中，同等濃度下triol-衍生物細胞毒性最大，但7β-OH衍生物和7-keto衍生物的細胞凋亡水平最高，且VC的添加可減少它們的細胞毒性，更有新型豆甾醇衍生物5，6，22，23-二環(huán)氧基豆甾烷和5，6-環(huán)氧基豆甾烷-22S，23S-二醇表現(xiàn)出了低濃度(30 μmol/L)高凋亡毒性［50］，但 POPs的這點對于化學療法選擇性致死癌癥細胞具有一定的研究價值。

Ryan等［49］在探究 POPs致使細胞凋亡的途徑時，發(fā)現(xiàn)7β-OH-谷甾醇氧化物和所有的豆甾醇氧化物都能降低U937細胞中谷胱甘肽，從而引起線粒體膜電位損失，最終使細胞色素c釋放進入胞液，活化細胞凋亡的蛋白酶，但是確切途徑還需進一步驗證。

總之，POPs的安全性問題尚未完全定論，對人體健康的具體影響和分析方法以及如何最小化其在食品和人體內含量是今后研究的重要方向。

7 結論

PS作為一種有效的生物活性組分已被廣泛應用在食品、醫(yī)藥和化妝品等行業(yè)。目前，利用超臨界萃取或固相萃取等現(xiàn)代提取分離技術提取植源性基料中的PS是期望的，再通過高速逆流色譜法分離純化，得到的精制PS再用GC分析。對于PS溶解性差的問題，主要引入了多不飽和脂肪酸進行油溶改性，使其營養(yǎng)功能最大化。在正常劑量下天然PS對人體基本無害，但對兒童和孕婦的影響還有待研究。至于POPs，它不僅沒有降膽固醇效果，還可能引起動脈粥樣硬化和炎癥反應，干擾性激素分泌，并具有細胞毒性，高濃度下甚至引起細胞凋亡，因此探究各種POPs的生理活性和安全性問題將是今后研究的重要方向。

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