張夢梅，李小艷，胡露，周康，2，敖曉琳，2，何利，2，陳姝娟，2，劉書亮，2

1(四川農(nóng)業(yè)大學食品學院，四川雅安，625014)

2(農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程四川省重點實驗室，四川雅安，625014)

泡菜是以新鮮蔬菜為原料，經(jīng)鹽滲透、微生物發(fā)酵、香辛料增香作用而形成的浸漬品［1］，具有多種保健功能［2-4］，深受消費者喜愛。評價泡菜品質(zhì)的重要指標之一是風味物質(zhì)，其包括揮發(fā)性和不揮發(fā)性成分，不揮發(fā)性成分包括有機酸和氨基酸。有機酸是泡菜的味感物質(zhì)基礎，氨基酸是主要的鮮味物質(zhì)［5］，同時也是許多風味物質(zhì)的前體［6-7］。泡菜的風味物質(zhì)來源于蔬菜和香辛料自身含有的呈味物質(zhì)，發(fā)酵過程中微生物的代謝產(chǎn)物，發(fā)酵過程中酸、醇、醛類等反應形成的產(chǎn)物［8］。由于目前泡菜企業(yè)生產(chǎn)使用較多的乳酸菌為中溫型微生物，其發(fā)酵周期短，易過酸和過熟，然而生產(chǎn)上蔬菜的收獲和鹽漬多集中在冬季，中溫型乳酸菌對泡菜的發(fā)酵速度過慢而限制了工業(yè)化生產(chǎn)。另外，蔬菜表面的附生微生物中部分為致腐菌甚至可能存在致病菌，在泡菜發(fā)酵前期可能生長繁殖影響泡菜的安全性和品質(zhì)，所以常用12%以上鹽度進行控制。耐低溫乳酸菌的應用，不僅可以解決這一生產(chǎn)問題，而且在一定程度上可以抑制泡菜中雜菌的生長，減少敗壞，降低亞硝酸鹽含量，保持獨特的口感和風味［9］。本文以課題組［10］篩選的耐低溫植物乳桿菌和腸膜明串珠菌為菌種，采用前期研究優(yōu)化得到的2種不同菌種配比的人工發(fā)酵方式，比較分析低溫下2種人工發(fā)酵和老鹽水發(fā)酵泡白菜過程中的有機酸和游離氨基酸含量變化，為感官評價提供數(shù)據(jù)參考，同時為改進泡菜生產(chǎn)工藝、提高產(chǎn)品質(zhì)量和風味品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白菜、芹菜、生姜、大蒜、白糖、食鹽、白酒、青花椒、小紅椒、八角、香葉，均為市售。

植物乳桿菌(Lactobacilusplantarum)3m-1，腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)8m-9，分離于四川泡菜。

草酸、檸檬酸、酒石酸、蘋果酸、琥珀酸、乳酸、乙酸，均為色譜純。

1.2 方法

1.2.1 泡白菜制作

(1)菌劑制備:將菌種活化后，在10℃條件下用改良蔬菜汁培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h得到菌液，離心(2 700 r/min，10 min)，得到菌劑。

(2)白菜預處理:清洗，晾干，切分。

(3)泡白菜制作:實驗分為3組。低溫乳酸菌接種①:所用菌種為菌株8m-9，接種量為0.3%。裝罐時，鹽水由食鹽40 g/L，蔗糖40 g/L，香料汁16%，3 g/L CaCl2，白酒1%組成，蔬菜與鹽水的比例為1∶1，密封后置于10℃發(fā)酵。低溫乳酸菌接種②:所用菌種為菌株3m-1∶8m-9=2∶1，接種量為0.3%。裝罐時，鹽水由食鹽50 g/L，蔗糖20 g/L，香料汁16%，3 g/L CaCl2，白酒1%組成，其余同低溫乳酸菌接種①。老鹽水:不接種。裝罐時，向壇內(nèi)加的鹽水(食鹽含量50 g/L)是用從雅安市雨城區(qū)部分餐館收集的泡菜水與水按1∶1混合而成的，其余同低溫乳酸菌接種①。

1.2.2 有機酸測定

(1)樣品處理根據(jù)發(fā)酵方式與發(fā)酵周期的不同，取1.2.1 中低溫乳酸菌接種①(1、2、3、5、9、13、20 d)、低溫乳酸菌接種②(1、2、3、5、9 d)、老鹽水(1、2、3、5、11 d)3種發(fā)酵方式樣品100 g，搗碎后稱取5 g于50 mL容量瓶，加水定容。浸泡1 h(期間每隔20 min混勻1次)后過濾，取上清液，12 000 r/min離心5 min，取上清液，0.45 μm微孔濾膜過濾器過濾，收取濾液進行檢測。配制標準使用液(草酸2.5 mg/mL、檸檬酸15 mg/mL、酒石酸25 mg/mL、蘋果酸15 mg/mL、琥珀酸15 mg/mL、乳酸25 mg/mL、乙酸 30 mg/mL)，分別取2、10、50、75、100 μL，用超純水稀釋至 1 mL，0.45 μm微孔濾膜過濾器過濾，收取濾液進行檢測［11-12］。

(2)檢測條件色譜柱:Carbomix H-NP柱(10 μm，8%交聯(lián)度，7.830 0 mm);流動相:2.5 mmol/L H2SO4;柱溫:58℃;進樣量:5 μL;流速:0.6 mL/min;紫外檢測器波長:210 nm。以此條件建立標準曲線，并對樣品進行定量。

1.2.3 游離氨基酸測定

根據(jù)發(fā)酵方式與發(fā)酵周期的不同，取原料及1.2.1中低溫乳酸菌接種①(5、20 d)、低溫乳酸菌接種②(5、9 d)、老鹽水(5、11 d)3 種發(fā)酵方式樣品100 g，放入60℃烘箱烘干至恒重，研磨過篩(60目)，樣品送國家糧食局成都糧油食品飼料質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心測定游離氨基酸含量［13］。

1.2.4 泡白菜的感官評價

取1.2.1中低溫乳酸菌接種①(20 d)、低溫乳酸菌接種②(9 d)、老鹽水(11 d)3種發(fā)酵方式泡白菜成熟樣品，邀請10名具有食品專業(yè)背景的學生和老師組成評定小組依據(jù)文獻［14-16］對泡菜的形態(tài)、色澤、口感、口味、氣味、脆度進行感官評定(總體得分=形態(tài)×10%+色澤×10%+氣味×20%+口味×30%+脆度×30%)。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用SPSS.19進行差異顯著性(P＜0.05)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 泡白菜有機酸含量變化

2.1.1 有機酸標準品的HPLC圖譜及標準曲線線性相關性

有機酸標準品的HPLC圖譜如圖1所示，7種有機酸分離效果好。由表1可知，所測的7種有機酸的相關系數(shù)均大于0.999 0，說明相關性好，所測數(shù)據(jù)可靠。

圖1 7種有機酸標準圖譜Fig.1 The standard map of 7 standard organic acid

表1 7種有機酸標準曲線線性相關性Table 1 Liner equations for the standard curve of 7 standard organic acids

2.1.2 不同發(fā)酵方式制作泡白菜發(fā)酵過程中有機酸含量變化

利用高效液相色譜法對不同發(fā)酵方式制作泡白菜發(fā)酵過程中有機酸含量的測定結(jié)果見圖2、圖3、圖4。

由圖2、圖3和圖4可知，3種不同發(fā)酵方式泡白菜中的大多數(shù)有機酸的變化趨勢基本一致，但在幅度上存在一定的差異。泡菜發(fā)酵過程中共檢測出了6種有機酸，其中乙酸酸味較刺激，可以強化食欲;乳酸酸味柔和，有后酸味;蘋果酸有助于形成泡菜爽口的酸味;琥珀酸賦予泡菜類似于貝類的鮮味［11］。3種發(fā)酵方式均未檢出酒石酸，其原因可能是在發(fā)酵過程中被微生物分解利用或含量太少導致低于檢出限。蘋果酸、乳酸、乙酸在發(fā)酵過程中均呈增長趨勢，其中乳酸含量增長最多，可知發(fā)酵過程中生成的有機酸以乳酸為主。發(fā)酵結(jié)束時，草酸、檸檬酸和琥珀酸的含量與發(fā)酵初期相比，均呈現(xiàn)出下降的趨勢，可能是參與了微生物的代謝過程。老鹽水中微生物復雜，存在其他產(chǎn)酸菌株，故發(fā)酵過程中乳酸含量較高。低溫乳酸菌發(fā)酵①與低溫乳酸菌發(fā)酵②相比，草酸、蘋果酸和乙酸含量較多，而乳酸含量低，分析原因是低溫乳酸菌發(fā)酵①中使用的菌株8m-9為腸膜明串珠菌，進行異型乳酸發(fā)酵，產(chǎn)生乳酸的同時也產(chǎn)生乙醇和二氧化碳。3種方式發(fā)酵過程中，琥珀酸含量雖然均有減少，但低溫乳酸菌發(fā)酵的琥珀酸含量明顯高于老鹽水發(fā)酵，可能是發(fā)酵過程中乳酸菌產(chǎn)生了琥珀酸［17］。

圖2 低溫乳酸菌接種①發(fā)酵過程中有機酸變化Fig.2 Changes of organic acids during artificial inoculation①fermentation process

圖3 低溫乳酸菌接種②發(fā)酵過程中有機酸變化Fig.3 Changes of organic acids during artificial inoculation②fermentation process

圖4 老鹽水發(fā)酵過程中有機酸變化Fig.4 Changes of organic acids during aged bring fermentation process

2.2 不同發(fā)酵方式制作泡白菜發(fā)酵過程中游離氨基酸變化

3種發(fā)酵方式泡白菜發(fā)酵過程中游離氨基酸含量的測定結(jié)果見表2。由表2可知，從泡菜樣品中共檢測出了17種氨基酸組分。3種發(fā)酵方式的氨基酸種類相同，但含量各不相同，可能與發(fā)酵環(huán)境中微生物的群落結(jié)構(gòu)有關。3種發(fā)酵方式的游離氨基酸總量均有不同程度的減少，其中老鹽水發(fā)酵泡菜的總氨基酸下降幅度較大(P＜0.05)，從發(fā)酵前的291.20 mg/100g降至發(fā)酵后的120.58 mg/100g。發(fā)酵后期，低溫乳酸菌接種發(fā)酵泡白菜中的必需氨基酸含量明顯高于老鹽水發(fā)酵泡白菜中的含量(P＜0.05)。發(fā)酵后期，3種發(fā)酵方式生產(chǎn)出的泡白菜中的必需氨基酸(EAA)占氨基酸總量(TAA)的48.41%、49.49%、29.91%，必需氨基酸與非必需氨基酸(NEAA)的比值分別為 93.84%、97.98%、42.67%。2種低溫乳酸菌發(fā)酵泡白菜都符合FAO/WHO所提出的較好的氨基酸組成為EAA/TAA在40%，EAA/NEAA在60%以上的標準［18］。低溫乳酸菌發(fā)酵泡白菜中的天冬氨酸和精氨酸的含量也同樣高于老鹽水發(fā)酵泡白菜中的含量，天冬氨酸是生物體內(nèi)賴氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸等必需氨基酸及嘌呤、嘧啶堿基的合成前體［19］;精氨酸作為半必需氨基酸，對人體來說同樣重要，如體內(nèi)缺少精氨酸會導致血氨過高，影響機體正常的生長和發(fā)育［20］。

表2 不同發(fā)酵方式泡白菜發(fā)酵過程中游離氨基酸成分表Table 2 Free amino acid compounds during cabbage fermentation process with different fermentation methods

氨基酸不僅是維持機體正常代謝的重要物質(zhì)，還具有調(diào)和風味的作用。根據(jù)氨基酸對滋味的貢獻，可以分為4類:鮮味氨基酸、甜味氨基酸、酸味氨基酸和苦味氨基酸［14，21］。3種發(fā)酵方式的泡白菜成品中的甜味氨基酸含量分別占氨基酸總量的60.35%、61.65%、67.94%，苦味氨基酸較發(fā)酵前含量略有減少。低溫乳酸菌接種發(fā)酵泡白菜中的天冬氨酸和谷氨酸，經(jīng)過發(fā)酵含量顯著增加，而老鹽水發(fā)酵中的這2種氨基酸則明顯下降(P＜0.05)。天冬氨酸和谷氨酸與Na+結(jié)合時會使產(chǎn)品鮮味倍增［22］，賦予泡菜更鮮美的滋味，使得人工接種泡菜風味更佳。

2.3 不同發(fā)酵方式制作的泡白菜感官評價結(jié)果

通過對3種發(fā)酵方式的成熟泡白菜進行感官評價，結(jié)果表明，低溫乳酸菌接種①、低溫乳酸菌接種②、老鹽水的泡白菜的感官評分分別為85.77±2.27，84.22±2.87，82.32±2.68，3者之間差異不顯著(P＞0.05)，但低溫乳酸菌接種發(fā)酵泡白菜略優(yōu)于老鹽水發(fā)酵泡白菜，這與測定的有機酸組成及游離氨基酸含量基本一致。

3 討論與結(jié)論

本文研究了低溫條件下3種不同發(fā)酵方式制作的泡白菜樣品中有機酸和游離氨基酸含量的變化。人工接種發(fā)酵泡菜與自然發(fā)酵泡菜均檢測到了6種有機酸和17種游離氨基酸。這3種發(fā)酵方式制得的泡白菜樣品中的有機酸的變化趨勢基本一致，只是變化幅度有所不同，與朱文嫻等［23］的研究結(jié)果類似。對比發(fā)酵末期樣品中各有機酸的含量，可以看出人工發(fā)酵泡菜中檸檬酸、蘋果酸、琥珀酸的含量較老鹽水發(fā)酵泡菜中的含量豐富。其中，檸檬酸和蘋果酸的味道醇和、刺激性?。?4］，琥珀酸能賦予產(chǎn)品貝類的鮮味，使得泡菜風味更佳。發(fā)酵末期，人工發(fā)酵泡菜樣品中的氨基酸總量、EAA/TAA、EAA/NEAA含量均大于老鹽水發(fā)酵泡菜，不同于黃業(yè)傳等［25］得出的人工接種發(fā)酵蔬菜產(chǎn)品中的氨基酸總含量略低于自然發(fā)酵的結(jié)果。從有機酸和游離氨基酸種類與含量，以及感官評價結(jié)果來看，可用低溫乳酸菌接種發(fā)酵方式代替老鹽水發(fā)酵。

常溫乳酸菌發(fā)酵速度快周期短，產(chǎn)品易過酸和過熟。為防止蔬菜變質(zhì)保證產(chǎn)品安全，生產(chǎn)上常增加食鹽的使用量，不僅影響口感，且增加了食鹽使用成本，甚至鹽漬蔬菜脫鹽后可導致鹽水排放污染環(huán)境進而增加廢水處理成本。而低溫乳酸菌發(fā)酵能很好地解決泡菜企業(yè)冬季鹽漬蔬菜發(fā)酵受低溫限制以及用鹽量較高的生產(chǎn)問題，產(chǎn)品風味也更加飽滿、柔和。雖然發(fā)酵周期略長，但發(fā)酵過程易于控制，可提升泡菜產(chǎn)品的品質(zhì)。老鹽水發(fā)酵體系中雜菌較多，菌群結(jié)構(gòu)復雜多變，產(chǎn)品的質(zhì)量與風味難以維持穩(wěn)定，難以適應規(guī)模化、產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。故選擇合適的發(fā)酵劑進行人工接種，以實現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)非常必要。本文結(jié)果顯示，人工接種低溫乳酸菌發(fā)酵泡菜能達到老鹽水發(fā)酵泡菜的感官風味品質(zhì)，一些品質(zhì)指標甚至優(yōu)于老鹽水發(fā)酵泡菜。研究結(jié)果為實現(xiàn)低溫乳酸菌接種發(fā)酵生產(chǎn)泡菜提供了理論依據(jù)，對提高產(chǎn)品質(zhì)量、降低食鹽使用成本有重要意義。

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