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輻射松半胱氨酸蛋白酶OTUBAIN-like基因生物信息分析*

吳建忠

(黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 經(jīng)濟(jì)作物研究所，哈爾濱黑龍江150086)

摘要：利用生物基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫，對輻射松半胱氨酸OTUBAIN-like基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，預(yù)測該基因編碼蛋白的理化性質(zhì)、序列特征、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與生物學(xué)功能。結(jié)果表明，輻射松半胱氨酸OTUBAIN-like基因編碼的蛋白質(zhì)含294個(gè)氨基酸，具有非跨膜結(jié)構(gòu)，含保守的PeptidaseC65結(jié)構(gòu)域，預(yù)測其可能在蛋白質(zhì)的翻譯、合成及代謝中對脅迫應(yīng)答和免疫應(yīng)答等功能起關(guān)鍵性作用，本研究為輻射松半胱氨酸蛋白酶的OTUBAIN-like基因功能深入研究奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：輻射松；半胱氨酸蛋白酶；生物信息學(xué)

半胱氨酸蛋白酶是一種蛋白水解酶，一般通過特定的抑制劑來鑒定其活化位點(diǎn)，而硫醇化合物可使之活化[1]。植物中半胱氨酸蛋白酶大多屬于papain(木瓜蛋白酶)(C1)、legumain(豆類天冬氨酸蛋白內(nèi)切酶)(C13)、caspase(天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白酶)(C14)和calpain(鈣依賴半胱氨酸蛋白內(nèi)切酶)(C2)家族[2]。研究發(fā)現(xiàn)了催化蛋白去泛素化的類蛋白酶和蛋白酶體[3～4]。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)與蛋白質(zhì)質(zhì)量控制、細(xì)胞周期、DNA修復(fù)、轉(zhuǎn)錄及免疫應(yīng)激等密切相關(guān)，也與許多種疾病的發(fā)生相關(guān)[5]。輻射松(Pinusradiata)體細(xì)胞胚胎發(fā)生時(shí)期對半胱氨酸蛋白酶的研究表明，一種新型的OTUBAIN-like基因優(yōu)先表達(dá)，這是首次發(fā)現(xiàn)在高等植物中參與泛素途徑的prOTUBAINS家族成員[6]。本研究基于NCBI上公布的輻射松半胱氨酸蛋白酶OTUBAIN-like基因(GenBank:EF405823)，進(jìn)行該基因及其編碼蛋白質(zhì)進(jìn)行了一系列的生物信息學(xué)分析，以期為半胱氨酸蛋白酶的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1序列來源

輻射松半胱氨酸蛋白酶OTUBAIN-like基因(EF405823)來源與NCBI網(wǎng)站的GenBank數(shù)據(jù)庫，GI號為148362048。

1.2研究方法

氨基酸序列分析通過NCBI數(shù)據(jù)庫找到輻射松半胱氨酸蛋白酶類泛素基因的mRNA完整編碼序列，用在線分析數(shù)據(jù)庫ORF Finder進(jìn)行基因開放讀碼框與其編碼氨基酸序列分析[7]。

蛋白質(zhì)基本信息分析利用ProtParam工具分析蛋白質(zhì)的基本信息[8]，登錄網(wǎng)站http://www.expasy.org/tools/pi_tool推測蛋白質(zhì)的分子量和理論等電點(diǎn)，ProtScale工具進(jìn)行蛋白質(zhì)疏水性/親水性分析[9]，蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域通過CDD分析獲得[10]，信號肽預(yù)測通過SignalP在線分析獲得[11]，跨膜區(qū)預(yù)測利用TMHMM方法在線分析[12]，亞細(xì)胞定位通過TargetP分析[13]，利用在線分析軟件SOPMA預(yù)測蛋白的二級結(jié)構(gòu)[14]。

蛋白功能預(yù)測在線軟件ProtFun進(jìn)行蛋白功能預(yù)測[15]，采用BlastP在線軟件進(jìn)行蛋白的序列同源性分析[16]。

2結(jié)果與分析

2.1基因開放閱讀框分析

開放閱讀框(Open reading frame，ORF)是基因序列的一部分，可能是蛋白質(zhì)編碼序列的部分，包含一段可以編碼蛋白的堿基序列，不能被終止子打斷。ORF的識別是證明一個(gè)新的DNA序列為特定的蛋白質(zhì)編碼基因的部分或全部的先決條件[17]。

輻射松半胱氨酸蛋白酶OTUBAIN-like基因全長1 238 bp(base pairs)(圖1)，單鏈分子量為374 364.00 D(Daltons)，雙鏈分子量為751 223.00 D(Daltons)，GC含量為43.38 %，AT含量為56.62 %，核苷酸數(shù)量及比例情況(表1)。該基因5’UTR長為125 bp，含15 bp的帽子結(jié)構(gòu)，3’UTR長為227 bp，具有polyA尾，表明該基因結(jié)構(gòu)完整。通過數(shù)據(jù)庫ORF Finder分析發(fā)現(xiàn)，該基因起始密碼子位于126 bp，終止密碼子位于1 008 bp，編碼294個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)。

圖1　輻射松半胱氨酸蛋白酶類泛素基因全長及編碼蛋白質(zhì)序列

核苷酸數(shù)量比例/%A35929.00C23218.74G30524.64T34227.63

2.2基因編碼蛋白的理化性質(zhì)

蛋白質(zhì)的基本性質(zhì)包括其相對分子質(zhì)量、氨基酸組成、分子式和理論等電點(diǎn)等[18]。經(jīng)BLAST序列比對，得到輻射松半胱氨酸蛋白酶OTUBAIN-like蛋白序列(Query ID：ABQ59604)(圖1)，利用ProtParam工具進(jìn)行其基本理化性質(zhì)分析，氨基酸和原子組成情況分別見表2和表3，氨基酸數(shù)目最多的是谷氨酸(Glu)和纈氨酸Val，分別占9.2 %和8.5 %，分子式為C1484H2299N383O458S12，294個(gè)氨基酸的相對分子量為33 218.59 D，消光系數(shù)在280 nm時(shí)為22 265，其不穩(wěn)定指數(shù)為45.46，表明該蛋白穩(wěn)定性一般，脂肪系數(shù)為91.77，總平均親水性為-0.115，說明該蛋白的疏水性較弱。負(fù)電荷殘基(Asp+Glu)總數(shù)為51，正電荷殘基(Arg+Lys)總數(shù)為29，經(jīng)等電點(diǎn)預(yù)測(http://cn.expasy.org/tools/pi_tool.html)顯示其理論等電點(diǎn)為4.65。

表2　氨基酸組成

表3　原子組成

圖2　蛋白序列的ProtScale分析

2.3基因編碼蛋白疏水性/親水性預(yù)測及分析

氨基酸側(cè)鏈的疏水性以各氨基酸減去甘氨酸疏水性之值來表示，蛋白質(zhì)的疏水性在保持蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的形成和穩(wěn)定中起著重要作用[19]。利用在線分析軟件ProtScale工具進(jìn)行該OTUBAIN-like蛋白的疏水性預(yù)測分析(圖2)，說明該蛋白疏水區(qū)域和親水區(qū)域均等，很難預(yù)測該蛋白的疏水性，因此結(jié)合其脂肪系數(shù)總平均親水性，可以判定該蛋白疏水區(qū)域和親水區(qū)域均等分布，進(jìn)一步表明該蛋白穩(wěn)定性一般。

2.4基因編碼蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測及分析

通過CDD分析蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)從34到288氨基酸之間含有保守的Peptidase_C65結(jié)構(gòu)域(圖3)，經(jīng)Cn3D macromolecular structure viewer進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域模型分(圖4)，圖中A、B、C和D分別為蛋白質(zhì)Wire、Space Fill、Worms和Ball and Stick模型結(jié)構(gòu)。將OTUBAIN-like蛋白用TMHMM 2.0分析得知，該蛋白不含跨膜結(jié)構(gòu)域，表明該蛋白是非跨膜蛋白。

圖3　蛋白的保守結(jié)構(gòu)域

圖4　蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域模型

圖5　OTUBAIN-like蛋白的TargetP分析

2.5基因編碼蛋白亞細(xì)胞定位

為確定OTUBAIN-like基因編碼蛋白的亞細(xì)胞定位情況，采用在線軟件TargetP分析結(jié)果(圖5)，表明該蛋白既不是葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽，也不是線粒體靶向肽，預(yù)測有可能是分泌通路信號肽和其他信號蛋白。利用在線軟件SignalP 4.1 Server對該OTUBAIN-like蛋白進(jìn)行信號肽結(jié)構(gòu)預(yù)測分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白不具有信號肽結(jié)構(gòu)，推測其不是分泌通路信號肽。

2.6基因編碼蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

對輻射松半胱氨酸蛋白酶OTUBAIN-like基因編碼蛋白二級結(jié)構(gòu)的分析將為進(jìn)一步深入了解其生物學(xué)結(jié)構(gòu)及功能奠定基礎(chǔ)，蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)主要是指多肽鏈依賴氫鍵排列的具有周期性結(jié)構(gòu)的構(gòu)象，對其進(jìn)行預(yù)測和分析將有助于認(rèn)識蛋白的空間結(jié)構(gòu)，采用SOPMA分析軟件預(yù)測輻射松半胱氨酸蛋白酶OTUBAIN-like基因編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)(圖6，表4)，該蛋白由44.22 %α-螺旋(Helix)，14.29 %延伸鏈(Strand)，8.84 %β-折疊(Turn)，32.65 %無規(guī)則卷曲(Coil)組成。由此可推測，α-螺旋和無規(guī)則卷曲是該蛋白主要的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)元件，部分的延伸鏈和β-折疊則散布于整個(gè)蛋白質(zhì)中。

圖6　蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測示意圖

二級結(jié)構(gòu)數(shù)量比例/%α-螺旋(Alphahelix-Hh)13044.22延伸鏈(Extendedstrand-Ee)4214.29β-折疊(Betaturn-Tt)268.84無規(guī)則卷曲(Randomcoil-Cc)9632.65

2.7基因編碼蛋白功能預(yù)測與分析

利用在線軟件ProtFun 2.2 server進(jìn)行輻射松半胱氨酸蛋白酶OTUBAIN-like基因編碼蛋白功能預(yù)測(表5)，該蛋白具有蛋白質(zhì)翻譯、脂肪酸代謝、生物合成輔酶因子、嘌呤與嘧啶和能量代謝功能的可能性分別為3.254、2.690、2.144、1.601和1.561，因此預(yù)測該蛋白可能蛋白質(zhì)翻譯、生物合成及代謝過程中有重要作用，結(jié)合其在GO功能分析的結(jié)果(圖7)顯示，輻射松半胱氨酸蛋白酶OTUBAIN-like基因編碼蛋白可能在蛋白質(zhì)的翻譯、合成及代謝中其脅迫應(yīng)答和免疫應(yīng)答功能起關(guān)鍵性作用。

2.8基因編碼蛋白序列同源性分析

經(jīng)BlastP在線進(jìn)行蛋白質(zhì)的序列同源比對(圖8)，輻射松半胱氨酸蛋白酶OTUBAIN-like基因編碼蛋白(ABQ59604)與北美云杉(Piceaspp.)的一個(gè)未知功能蛋白(ABK21173)序列結(jié)構(gòu)同源性最高，相似性高達(dá)98 %，與蓮花(Nelumbonucifera)泛素硫酯酶OTUBAIN-like異構(gòu)體X1(XP_010250517)及海棗(Phoenixdactylifera)泛素硫酯酶OTUBAIN-like同源性都較高，相似性分別達(dá)85 %和81 %。

表5　 輻射松半胱氨酸蛋白酶OTUBAIN-like基因

圖7　輻射松半胱氨酸蛋白酶OTUBAIN-like基因編碼蛋白GO功能分類

圖8　氨基酸序列保守結(jié)構(gòu)同源分析

3結(jié)論與討論

半胱氨酸蛋白酶是植物中一類重要的蛋白酶家族。目前，在中華獼猴桃(Actinidiachinensis)果實(shí)[20]、大麥(Hordeumvulgare)種子[21]、豇豆(Vignaunguiculata)子葉[22]、豌豆(Pisumsatium)種子[23]及甘薯(Ipomoeabatatas)[24]等作物中均分離到了相關(guān)的半胱氨酸蛋白酶家族成員。研究顯示半胱氨酸蛋白酶的富集不僅出現(xiàn)在干旱[25～26]、鹽脅迫[23]等環(huán)境脅迫條件下，還與植物的細(xì)胞程序化死亡[27～28]、器官分化及木質(zhì)部發(fā)生或分化[29]存在一定的聯(lián)系，但半胱氨酸蛋白酶在植物響應(yīng)非生物及生物脅迫、器官分化及衰老的過程中所發(fā)揮的功能和作用機(jī)制尚未得到詳盡的簡析。本研究通過輻射松半胱氨酸蛋白酶OTUBAIN-like基因生物信息學(xué)分析，該基因含1 238 bp，結(jié)構(gòu)完整，編碼由249個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白，含20種氨基酸，分子量為33 218.59 D，理論等電點(diǎn)PI為4.65，疏水性較弱，穩(wěn)定性一般，分子式為C1484H2299N383O458S12，含有保守的Peptidase_C65結(jié)構(gòu)域，不含跨膜結(jié)構(gòu)，不具有葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽、線粒體靶向肽及分泌通路信號肽的亞細(xì)胞定位結(jié)構(gòu)，經(jīng)蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析，α-螺旋和無規(guī)則卷曲是該蛋白主要的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)元件，部分的延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角則散布于整個(gè)蛋白質(zhì)中，預(yù)測其可能在蛋白質(zhì)的翻譯、合成及代謝中其脅迫應(yīng)答和免疫應(yīng)答功能起關(guān)鍵性作用，因此，推斷該蛋白酶可能作為一種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)。本研究將為輻射松半胱氨酸蛋白酶OTUBAIN-like基因功能的深層次挖掘研究奠定基礎(chǔ)。

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Bioinformatics Analysis of Cysteine Protease TUBAIN-like Gene

in Pinus radiata

WU Jian-zhong

(Institute of Industrial Crops,Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences,Harbin Heilongjiang 150086 P.R.China)

Abstract:To forecast the physical and chemical properties, sequence characteristics,structure and biological function of the gene encoding protein,bioinformatics analysis of Cysteine Protease OTUBAIN-like gene in Pinus radiata with genomics database was conducted.The results showed that the protein encoded by the Pinus radiata Cysteine Protease OTUBAIN-like gene contains 294 amino acids,and it has the conservative PeptidaseC65 domain but no cross membrane structure.This study may play a critical role in protein synthesis and metabolism on stress response and immune response function.

Key words:Pinus radiata;OTUBAIN-like;bioinformatics

中圖分類號：S 792.252

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1672-8246(2015)05-0001-08

作者簡介：吳建忠(1983-)，男，助理研究員，博士生，主要從事亞麻遺傳育種及基因組學(xué)研究。E-mail：wujianzhong176@163.com

基金項(xiàng)目：哈爾濱市科技創(chuàng)新工程青年基金(2013RFQYJ010) 。

收稿日期：*2015-03-27

doi10.16473/j.cnki.xblykx1972.2015.05.001