徐迪，王歡，耿文靜，楊蕾蕾，卜繁玲，李原野，張英華

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030）

0 引言

酸奶是比較適合人體營養(yǎng)需要的一種乳制品，但隨著農(nóng)藥大量使用，酸奶的原料乳中農(nóng)藥殘留可能進(jìn)入食物鏈對(duì)人類健康產(chǎn)生威脅[1]，如有些有機(jī)磷農(nóng)藥進(jìn)入生物體影響神經(jīng)中樞系統(tǒng)[2]。經(jīng)有關(guān)研究確認(rèn)加工處理可為食品安全提供保障[3]。因此乳制品中農(nóng)藥污染問題應(yīng)得到重視。

目前有氣相色譜（GC），高效液相色譜（HPLC）[4]，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）[5]，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）[6]等農(nóng)藥殘留分析技術(shù)。本文采用GC測(cè)定有機(jī)磷農(nóng)藥殘留，目前有機(jī)磷農(nóng)藥殘留GC檢測(cè)應(yīng)用在糧食、蔬果較廣泛，而應(yīng)用在酸奶等乳制品還很少。所以本文針對(duì)酸奶這樣復(fù)雜基質(zhì)中的有機(jī)磷農(nóng)藥殘留進(jìn)行檢測(cè)分析，優(yōu)化處理方法及色譜條件使其更好地應(yīng)用到酸奶等乳制品的檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑及儀器設(shè)備

脫脂乳粉。有機(jī)磷農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品：二嗪磷、久效磷、樂果、甲基對(duì)硫磷、馬拉硫磷、毒死蜱、對(duì)硫磷、殺螟硫磷。色譜級(jí)丙酮、氯甲烷、乙腈、丙酮、無水硫酸鈉等為國產(chǎn)分析純藥品。

氣相色譜儀Agilent7890配火焰光度檢測(cè)器，色譜柱：DB1701；高速離心機(jī)LG10-2.4A；氮吹儀MTN-2800D。

1.2 色譜條件

DB-1701色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 mm)；進(jìn)樣口溫度200℃，F(xiàn)PD檢測(cè)器250℃。程序升溫：初始溫度90℃(保持1 min)，以15℃/min升至260℃(保持3 min)；載氣(N2)流速10 mL/min。

載氣為高純氮?dú)猓兌取?9.999%，流速10 mL/min；燃?xì)鉃闅錃?，純度?9.999%，流速75 mL/min；助燃?xì)鉃榭諝?，流?00 mL/min。

進(jìn)樣方式為不分流進(jìn)樣。進(jìn)樣體積1.0 μL，以保留時(shí)間定性，峰面積定量。

1.3 酸奶樣品的處理[7]

稱取10.0 g酸奶樣品于50 mL離心管中，加入10 mL提取液(丙酮∶乙腈=1∶4)，浸泡0.5 h然后將其離心6 000 g離心6 min上清液收集于150 mL分液漏斗中，離心管再加入10 mL提取液，重復(fù)提取1次，合并上清液于分液漏斗中。分液漏斗中分別加入25 mL和10 mL二氯甲烷劇烈振搖2次，每次振搖10 min，靜置、分層，將二氯甲烷相收集50 mL容量瓶中，加入3.0 g無水硫酸鈉除去水；過濾，取5mL提取液用氮吹儀吹至近干，用色譜純丙酮定容到1.0 mL，0.45 μm有機(jī)濾膜過濾，氣相色譜儀測(cè)定，外標(biāo)法定量。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 計(jì)算

氣相測(cè)定結(jié)果為

式中：X為樣品中農(nóng)藥的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(mg/kg)；C為標(biāo)準(zhǔn)溶液中農(nóng)藥質(zhì)量濃度(mg/L)；m為樣品質(zhì)量(g)；V為提取溶劑的總體積(mL)；M2為吸取出用于檢測(cè)的提取溶液的質(zhì)量(g)；M1為樣品最后的質(zhì)量(g)；S1為樣品中被測(cè)農(nóng)藥峰面積；S0為農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液中被測(cè)農(nóng)藥的峰面積。

檢測(cè)限計(jì)算公式為

式中：DL為檢出限（mg/kg）；N為基線噪聲；C為樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)(mg/kg)；h為樣品峰高。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的分析

因有機(jī)磷農(nóng)藥結(jié)構(gòu)、極性、熔沸點(diǎn)等存在差異，故色譜條件的選擇直接影響不同種類農(nóng)藥的色譜分離效果。而色譜柱的選擇是整個(gè)色譜條件優(yōu)化的重要環(huán)節(jié)，實(shí)驗(yàn)初步選用弱性的HP-5毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 mm)和中極性的DB-1701毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 mm)，但是HP-5毛細(xì)管柱經(jīng)過反復(fù)實(shí)驗(yàn)，很難使毒死蜱和對(duì)硫磷分開，而DB-1701毛細(xì)管柱把8種農(nóng)藥得到很好分離。關(guān)于有機(jī)磷多殘留分析的方法的文獻(xiàn)很多，多采用FPD[8-10]，有采用NPD[11-12]，在現(xiàn)有氣相色譜儀Agilent7890，F(xiàn)PD檢測(cè)器的條件下，進(jìn)行色譜條件的優(yōu)化。

進(jìn)樣口溫度的選擇，一般要接近樣品中沸點(diǎn)最高組分的沸點(diǎn)，但要低于易分解組分的分解溫度，檢測(cè)器溫度的設(shè)置原則是保證流出色譜柱的組分不會(huì)冷凝，同時(shí)滿足檢測(cè)器靈敏度的要求，色譜柱溫度的確定主要由樣品的復(fù)雜程度和汽化溫度決定，原則是既要保證待測(cè)物的完全分離，又要保證所有組分能流出色譜柱，并且分析時(shí)間越短越好，根據(jù)以上原則本試驗(yàn)進(jìn)行多次分離試驗(yàn)后，確定進(jìn)樣口溫度200℃，檢測(cè)器溫度250℃，色譜柱溫度90℃，在該條件下8種農(nóng)藥分離良好，基線平穩(wěn)，檢測(cè)器靈敏度高，分析時(shí)間在14 min內(nèi)，8種農(nóng)藥的氣象色譜圖如圖1所示。本研究是在酸奶體系中進(jìn)行檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥的殘留情況，如圖2所示，8種農(nóng)藥殘留達(dá)到有效的分離程度，并且樣品中無明顯的雜質(zhì)峰出現(xiàn)。

圖1 8種有機(jī)磷農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品色譜

圖2 酸奶樣品中8種有機(jī)磷農(nóng)殘色譜

圖1和圖2中，1為二嗪磷；2為久效磷；3為樂果；4為甲基對(duì)硫磷；5為毒死蜱；6為馬拉硫磷；7為殺螟硫磷；8為對(duì)硫磷。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

以標(biāo)準(zhǔn)樣品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，獲得8種有機(jī)磷農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖3 8種有機(jī)磷農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖3可以看出，8種有機(jī)磷農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)曲線呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，可以得知標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程及相關(guān)系數(shù)。通過檢測(cè)限計(jì)算公式可以計(jì)算出樣品的檢出限0.005～0.019 mg/kg的范圍之內(nèi)，結(jié)果如表1所示.

表1 8有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的回歸方程、保留時(shí)間、相關(guān)系數(shù)及檢出限

該實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的各種農(nóng)藥質(zhì)量分?jǐn)?shù)值與響應(yīng)峰面積值之間的線性關(guān)系，除久效磷的線性關(guān)系稍微偏小0.9981外，其它農(nóng)藥的線性關(guān)系均達(dá)到0.999以上，完全滿足實(shí)驗(yàn)要求，一定程度上驗(yàn)證了該方法的準(zhǔn)確性及應(yīng)用性。由表1可知，8種農(nóng)藥無論從分離效果還是峰型上都非常好，說明該方法能夠有效的將8種有機(jī)磷農(nóng)藥進(jìn)行分離。

2.3 樣品加標(biāo)回收率測(cè)定

取10.0 g空白奶樣，分別添加8種有機(jī)磷農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)液，使其在樣品中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.25，0.50和1.00 mg/kg的3個(gè)添加水平，每個(gè)水平重復(fù)3次，得到的回收率和標(biāo)準(zhǔn)偏差的測(cè)定結(jié)果如表2所示。

表2 酸奶中8種農(nóng)藥的添加回收實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

由表2可以看出，8種農(nóng)藥的回收率范圍分別為89.78%～92.99%，84.51%～94.70%，86.21%～95.88%，86.21%～92.87%，88.27%～93.91%，86.38%～105.96%，88.51%～96.64，88.20%～109.55%，平均回收率均在84%以上。結(jié)果表明，該方法具有較高的精密度和準(zhǔn)確度，可用作這8種農(nóng)藥殘留的定量分析。

3 討論

3.1 提取試劑的選擇

基于酸奶這種復(fù)雜體系進(jìn)行研究的，由于原料乳中有大量的蛋白質(zhì)，所以在提取劑的選擇和萃取的時(shí)間及萃取的力度方面存在著挑戰(zhàn)性。徐路妹[13]比較了乙腈，乙酸乙酯和丙酮做萃取劑時(shí)農(nóng)藥殘留的提取效果，發(fā)現(xiàn)乙腈效果最好。張貴群[14]也認(rèn)為乙腈提取效果最好，但由于乙腈毒性及價(jià)格的關(guān)系所以在試驗(yàn)中建議用丙酮-水而未采用乙腈。而該實(shí)驗(yàn)酸奶中農(nóng)殘檢驗(yàn)要求高，原料乳中的蛋白質(zhì)還易引起乳化現(xiàn)象，很難分層，使回收率大大降低，所以經(jīng)過反復(fù)實(shí)驗(yàn)，調(diào)整各提取試劑的比例，最終確定丙酮、乙腈（1∶4）和二氯甲烷?？梢酝瑫r(shí)提取多種有機(jī)磷農(nóng)藥，且提取效果好、操作簡單，仍是一種首選的萃取試劑。

3.2 樣品處理簡單，無乳化現(xiàn)象

樣品前處理不需要過柱的步驟，只需用0.45 μm的有機(jī)相濾膜過濾來進(jìn)行凈化處理，大縮短了分析時(shí)間，并且凈化徹底，色譜圖中沒有出現(xiàn)雜質(zhì)峰。一般萃取含有蛋白和脂肪的物質(zhì)時(shí)會(huì)引起乳化現(xiàn)象，本實(shí)驗(yàn)最終注意以下幾點(diǎn)后，樣品在萃取時(shí)無乳化的現(xiàn)象。首先離心一定要使上清液澄清透明，不含有蛋白質(zhì)，其次提取液的比例要適當(dāng)，每次在萃取振搖時(shí)在單位時(shí)間里頻率一樣力度要適當(dāng)，力度過大也會(huì)引起乳化，如果以上方法還會(huì)出現(xiàn)乳化就加入少量的飽和食鹽水。

3.3 檢出限、回收率符合檢測(cè)要求

本實(shí)驗(yàn)研究農(nóng)藥的檢出限、回收率、標(biāo)準(zhǔn)偏差等參數(shù)都符合檢測(cè)要求，能夠應(yīng)用此方法對(duì)酸奶等乳制品進(jìn)行農(nóng)殘監(jiān)控。

4 結(jié) 論

研究結(jié)果表明：氣相色譜儀Agilent7890，F(xiàn)PD檢測(cè)器，進(jìn)樣口溫度200℃，檢測(cè)器溫度250℃，色譜柱溫度90℃；丙酮、乙腈（1∶4）和二氯甲烷萃取，8種有機(jī)磷農(nóng)藥（二嗪磷，久效磷，樂果，甲基對(duì)硫磷，毒死蜱，馬拉硫磷，殺螟硫磷，對(duì)硫磷）以0.25，0.50，1.00 mg/kg三個(gè)添加水平時(shí)的檢出限在0.005～0.019 mg/kg的范圍內(nèi)，平均回收率84.51%～109.55%，標(biāo)準(zhǔn)偏差＜4%，該方法快速、靈敏度高、選擇性好，各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)滿足酸奶體系中8種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留檢測(cè)要求。

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