謝玉珊，謝守新，宋陽，金夢,王金花，李小林，梁庭煒，林海丹，鄒志飛

（1.廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心，廣州510623；2.北京出入境檢驗檢疫局技術(shù)中心,北京100026）

0 引言

維生素D是一種脂溶性維生素，目前已知的維生素D至少有10種，但最重要的是維生素D2和維生素D3。維生素D對健康的意義被廣泛的認知。我國GB 14880-2012[1]將其列為營養(yǎng)強化劑,乳品中通常只添加維生素D3。

目前，國內(nèi)外維生素D檢測的傳統(tǒng)方法是液相色譜法，如我國國家標準方法[2]。近年來，選擇性強、靈敏度高的液相色譜-質(zhì)譜法[3]已有應(yīng)用于維生素D檢測的報道。液相色譜-質(zhì)譜法檢測的選擇性好，靈敏度高，操作簡便，較好滿足含量低的嬰幼兒乳品中維生素D的測定。

本研究采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對嬰幼兒乳品中維生素D3測定進行研究，采用同位素內(nèi)標法，同時優(yōu)化了樣品的前處理。方法簡便，準確。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇（HPLC級），正己烷，乙醇，無水硫酸鈉，氯化鈉，氫氧化鉀，抗壞血酸，維生素D3，氘代維生素D3標準品（Vitamin D3-2[H]2），純度≥99%）。

維生素D3標準儲備液（質(zhì)量濃度100 μg/mL）：精密稱取10 mg（精確至0.1 mg）維生素D3，用乙醇溶解并定容于100 mL棕色容量瓶中。

氘代維生素D3標準儲備液（質(zhì)量濃度500 μg/mL）：精密稱取5 mg（精確至0.1 mg）氘代維生素D3標準品，用乙醇溶解并定容于10 mL棕色容量瓶中。

氘代維生素D3標準工作液（質(zhì)量濃度1.00 μg/mL）：量取0.100 mL的氘代維生素D3標準儲備液（500 μg/mL），用乙醇定容至50 mL。

1.2 儀器與設(shè)備

AB 4000QTRAP串聯(lián)質(zhì)譜儀，島津液相色譜儀(四元低壓梯度輸液泵,自動進樣器,柱溫箱)，電噴霧離子源，Valco二位流路切換閥，AB公司Analyst儀器控制及數(shù)據(jù)處理軟件，分析天平，水浴振蕩器，Sigma 3-16PK離心機，IKA MS 3渦旋振蕩器，Mill-Q超純水器，氮吹儀，分液漏斗，三角錐瓶，比色管，吹氮管。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

稱取5 g（精確至0.01 g）試樣于250 mL三角瓶中，加入1 g維生素C，用45～50℃的水使其溶解，再加入30 mL乙醇、15 mL質(zhì)量分數(shù)為50%氫氧化鉀溶液，混合均勻后充氮，蓋上瓶蓋，置于85℃水浴振蕩中皂化40～50 min，取出立即水流冷卻至室溫。

用少量飽和氯化鈉溶液將上述皂化液全部轉(zhuǎn)入250 mL分液漏斗中，加入40 mL正己烷，輕輕搖動，排氣后蓋好瓶塞，劇烈振蕩提取，靜置分層，收集正己烷層，按上述方法用正己烷30 mL×2次萃取提取，合并正己烷溶液并用飽和氯化鈉溶液洗至近中性，收集正己烷層定容至100 mL，加入無水硫酸鈉振搖脫水，量取5.00 mL，加入100 μL氘代維生素D3標準工作液，于45℃氮氣吹干，乙腈定容至1 mL，渦旋混勻，經(jīng)0.45 μm有機相濾膜過濾后，供液相色譜質(zhì)譜測定。

1.3.2 色譜條件

色譜柱為YMC C18柱（50 mm×2.1 mm，3 μm）；流動相為甲醇(A)-5 mmol/L甲酸銨(B)，0～4 min,A為85%～100%；4～7 min,A為100%；7.01～10 min,A為85%；流速為0.35 mL/min；柱溫為40℃；進樣量為10 μL。

1.3.3 質(zhì)譜條件

2 結(jié)果與討論

表1 正TurboIonspray電離源（ESI）的各參數(shù)

表2 多反應(yīng)選擇離子監(jiān)測方式(MRM)的各參數(shù)

2.1 樣品前處理方法的優(yōu)化

乳品中維生素D是脂溶性的，經(jīng)典方法采用乙醇-氫氧化鉀溶液皂化，本方法改進了國標法，方法更加簡便實用。改進如下：減少稱樣量，原來10 g，修改為5 g，原方法加抗壞血酸乙醇溶液，改為直接加固體抗壞血酸，減少體系的溶劑體積，這樣有利于下一步于振蕩器中振搖皂化時振動充分，且不會濺出。振蕩皂化時使用的三角錐瓶的瓶塞的氣密性很重要，改用了聚四氟乙烯瓶塞，確保振搖皂化時瓶塞不會松脫，避免了空氣帶入造成維生素的氧化損失，從而使回收率穩(wěn)定。本方法提高了皂化溫度，實驗表明溫度提高至85℃，不影響維生素D3回收率，而油脂皂化更加徹底，有利于下一步的萃取凈化和儀器分析。改用正己烷替代石油醚，使萃取分層更加明顯，減少乳化。采用氮氣吹干部分萃取液，因為液相色譜質(zhì)譜法靈敏度比原國標法液相色譜法高許多，因此只需采用部分萃取液吹干后，定容分析已滿足檢測要求，既減少試劑損耗又縮短實驗時間。在吹干前加入內(nèi)標物，既校正了氮氣吹掃時維生素的損失又能有效校正質(zhì)譜分析時的基質(zhì)效應(yīng)。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

蠕動泵以10 μL/min的流速連續(xù)注射質(zhì)量濃度為0.1 mg/L的維生素D3標準溶液入TurboIonspray電離源中，在正離子檢測方式下對維生素D3進行一級質(zhì)譜分析（Q1掃描），得到分子離子峰，對各準分子離子峰進行二級質(zhì)譜分析（子離子掃描），得到碎片離子信息，維生素D3二級質(zhì)譜見圖1。由此確定定性用的各離子對。采用MRM模式采集數(shù)據(jù)，選擇駐留時間為100 ms,優(yōu)化各離子對的去簇電壓（DP），碰撞氣能量（CE），入口電壓(EP)，碰撞池出口電壓(CXP)。

采用“T”三通方式，即蠕動泵以10 μL/min的流速連續(xù)注射0.1mg/L的維生素D3標準溶液，流動相則以350 μL/min的流速與維生素D3標準溶液混合后進入離子源來進行優(yōu)化色譜流動相合離子源氣體的各參數(shù)。當分別用甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸、甲醇-0.1%乙酸、甲醇-5 mmol/L甲酸銨，甲酸銨的相應(yīng)值相對較高，采用乙腈代替甲醇，相應(yīng)值沒有明顯變化。因此選用甲醇-5 mmol/L甲酸銨作為流動相，

靈敏度足以滿足要求。

圖1 維生素D3的子離子全掃描色譜

2.3 色譜條件的優(yōu)化

經(jīng)質(zhì)譜條件篩選后選用甲醇-5 mmol/L甲酸銨溶液作為流動相，考察其色譜行為，維生素D3的峰形理想，對樣液進行分析，試驗梯度洗脫條件，確定最佳的洗脫梯度，標準和樣品的維生素D3及其內(nèi)標的多反應(yīng)監(jiān)測離子圖如圖2所示。

圖2 標準和樣品的維生素D3及其內(nèi)標的MRM（多反應(yīng)監(jiān)測離子圖）

2.4 線性范圍

用乙腈配成的一系列質(zhì)量濃度的標準混合工作溶液按實驗的儀器條件進行測定，以分析物與內(nèi)標物峰面積比(Y)-分析物與內(nèi)標物質(zhì)量濃度比(X)作校正曲線，得到線性回歸方程y=1.55×104x+7.83×103，維生素D3在0～50 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（相關(guān)系數(shù)為0.9999），相關(guān)系數(shù)均大于0.99，結(jié)果如表3所示。

2.5 回收率、精密度及定量限

采用本方法在嬰幼兒奶粉中添加維生素D3標準溶液，按方法進行回收率實驗，每個添加濃度重復(fù)測定6次，計算添加平均回收率和相對標準偏差，結(jié)果見表3。奶粉中維生素D3的平均回收率在83.9%～93.0%之間,變異系數(shù)為1.10%～4.90%,方法的準確度和精密度均符合殘留分析要求。實驗表明樣品中維生素D3在添加20 μg/kg水平時，信噪比（S/N）大于10，且回收率和精密度滿意，因此以20 μg/kg作為方法的定量限。

表3 奶粉中維生素D3的添加回收率和精密度(n=6)

2.6 實際樣品分析

采用本方法對經(jīng)多個實驗室比對標定維生素D3的奶粉質(zhì)控樣品進行測定，重復(fù)測定6次，平均測定值為82.1 μg/kg，變異系數(shù)為5.10%，結(jié)果在質(zhì)控的警戒控制線（72.3～97.0 μg/kg）內(nèi)。

3 結(jié)束語

本方法研究建立了乳品中維生素D3的高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法。方法的樣品的前處理簡單、易操作、定量準確，適用于乳品中維生素D3的檢測。與國標法比較，儀器的靈敏度提高了，不需采用半制備色譜的方法可以達到檢測的要求，減少試劑的消耗和縮短了檢測時間，同時質(zhì)譜法的定性的準確性高。與其它同類方法比，采用同位素內(nèi)標定量，有效降低基質(zhì)效應(yīng)，定量更為準確。

[1]GB 14880-2012《食品安全國家標準食品營養(yǎng)強化劑使用標準》[S].

[2]GB 5413.9-2010嬰幼兒食品和乳品中維生素A、D、E的測定[S]

[3]黃芳,吳惠勤,杭義萍.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定食品中維生素D2 和維生素D3[J].理化檢驗：化學分冊，2011，47（5），577-579，582.