高揚，唐祎，錢蕙佶，沈鵬，占東升，梁世排，張少輝，3

（1.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海200240；2.浙江熊貓乳業(yè)集團股份有限公司,浙江 溫州325800；3.上海交通大學(xué)陸伯勛食品安全研究中心，上海200240）

0 引言

生物活性肽具有易被吸收、毒性小等特點，且在促進(jìn)機體自身免疫等方面有著良好的前景，所以被視作新興藥物候選者[1-2]。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一系列生物活性肽，如細(xì)胞調(diào)節(jié)肽、抗氧化肽等[3-9]。

衰老與機體的穩(wěn)態(tài)機制的逐漸喪失緊密相關(guān)[10]，人們先后提出自由基學(xué)說、端粒學(xué)說、氧化-炎癥衰老學(xué)說等多種假說，其中自由基學(xué)說是非常重要的學(xué)說之一[11-15]。近年來，越來越多的人認(rèn)為免疫因素、遺傳因素、環(huán)境因素都會對機體的衰老產(chǎn)生影響[16]。金贏凱等通過實驗證明本研究室發(fā)現(xiàn)的生物活性肽具有很好的抗氧化活性[17]。周婕慧等已經(jīng)證明從牛奶發(fā)酵乳中提取的小肽QEPV能夠提升小鼠的抗炎癥能力，并提高小鼠體內(nèi)的多種還原酶活性，從而提高機體的抗氧化能力，緩解機體因炎癥而引起的氧化應(yīng)激狀態(tài)[18、19]。

本文以果蠅為實驗?zāi)Ｐ?，從果蠅的多種指標(biāo)的變化來研究QEPV對果蠅抗氧化能力的影響，并探討了其潛在機理。

1 實驗

1.1 材料與儀器

實驗動物：Oregon K野生型黑腹果蠅（Drosophila melanogaster），由上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院遺傳學(xué)實驗室提供。

實驗條件：采用普通玉米培養(yǎng)基培養(yǎng)，溫度（25±1）℃，相對濕度45%～75%，每2天更換新鮮培養(yǎng)基一次。

實驗試劑：瓊脂粉，購自國藥；蔗糖，過氧化氫，MDA脂質(zhì)過氧化物試劑盒，SOD超氧化物歧化酶試劑盒，乳源生物活性肽QEPV（委托上海淘普生物科技有限公司合成，純度＞98%）。

實驗儀器：Mettler-Toledo電子分析天平，上海恒科GRX-9072A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，Thermo超低溫冰箱，Tecan Pro-200酶標(biāo)儀，力康RO15純水系統(tǒng)，Eppendorf離心機，LRH-250F生化培養(yǎng)箱，上海元象生物科技有限公司組織勻漿器。

1.2 方法

1.2.1 果蠅生存實驗

以果蠅為實驗?zāi)Ｐ停菏占? h內(nèi)新羽化的果蠅成蟲，麻醉后分雌雄隨機轉(zhuǎn)移到各實驗組中，每組每個性別100只，每組設(shè)置3個平行，對照組給予普通玉米粉培養(yǎng)基，實驗組分別為含有質(zhì)量濃度為0.05，0.5，1 g/L的QEPV生物活性肽-玉米培養(yǎng)基。每2天更換新鮮培養(yǎng)基1次，每天觀察并記錄不同性別果蠅的死亡數(shù)，直到果蠅全部死亡為止。繪制果蠅生存曲線，并計算出不同性別果蠅的平均壽命和最高壽命（取最后死亡的5只果蠅進(jìn)行統(tǒng)計）。

1.2.2 繁殖力測定實驗

收集8 h內(nèi)新羽化的果蠅成蟲，將其雌雄分開喂養(yǎng)，培養(yǎng)基中分別加入質(zhì)量濃度為0，0.05，0.5，1 g/L的QEPV溶液，連續(xù)培養(yǎng)12 d。第13天收集相同濃度下培養(yǎng)的成年果蠅并轉(zhuǎn)移到新的普通培養(yǎng)瓶中，每個培養(yǎng)瓶保證1只雌性和2只雄性（每組5瓶），每瓶給予準(zhǔn)確的24 h進(jìn)行產(chǎn)卵。產(chǎn)卵后將親本果蠅轉(zhuǎn)移到新的普通培養(yǎng)瓶中，舊培養(yǎng)瓶繼續(xù)繁殖培養(yǎng)，待幼蟲羽化后統(tǒng)計后代數(shù)量，連續(xù)測定7，并重復(fù)3次。

1.2.3 過氧化氫急性毒性實驗

選取壽命實驗中結(jié)果較好的肽濃度培養(yǎng)基，設(shè)置空白對照組和實驗組，每組雌雄性別果蠅均為50只，其它條件與壽命試驗一致，對果蠅培養(yǎng)3周。然后同時將果蠅重新分組，每組取5只雄性和5只雌性果蠅轉(zhuǎn)移到一個新的容器中，新的容器內(nèi)含有一個紙質(zhì)圓盤，圓盤同時加入300 μL終濃度為5%的蔗糖溶液以及質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%過氧化氫1mL，空白組和實驗組均暴露在這種過氧化氫產(chǎn)生的毒性過氧化物環(huán)境中，每組設(shè)置10個平行樣，觀察其抗氧化能力。每4小時記錄果蠅死亡數(shù)量和性別，直到果蠅全部死亡。

1.2.4 果蠅超氧化物歧化酶 （SOD）活性和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）濃度測定

實驗設(shè)計同壽命延長實驗設(shè)計，飼養(yǎng)30 d后，每組稱取果蠅40 mg，加0.5 mL生理鹽水，在冰浴中研磨勻漿，間歇10 s，反復(fù)進(jìn)行3次，制成勻漿，按照試劑盒說明測定每組果蠅SOD活性及MDA濃度。利用MDA檢測試劑盒檢測果蠅體內(nèi)的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的濃度，分光光度計的波長為532 nm。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)處理

利用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)用均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差的形式表示。多組間比較采用單因素方差A(yù)NOVA中的LSD法進(jìn)行顯著性分析，并以P＜0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

衰老是生物體隨著時間的推移而發(fā)生的必然現(xiàn)象，主要表現(xiàn)在機能的不斷衰退、適應(yīng)能力和抵抗力的不斷減退。外界的不良環(huán)境刺激可使衰老過程加速,而在生物體自身的衰老過程中活性氧自由基也是一個不可忽視的因素[20]。目前已經(jīng)報道的諸多延緩衰老的活性物質(zhì)，大多數(shù)都是通過對自由基的抑制來實現(xiàn)其作用。

2.1 果蠅生存實驗結(jié)果

本研究對喂食不同質(zhì)量濃度生物活性肽的果蠅壽命的研究結(jié)果如圖1所示。由圖1（a）可以看出，相對于空白對照組雄性果蠅而言，喂食質(zhì)量濃度為0.05 g/L的QEPV并沒有顯著改變雄性果蠅的存活率，而當(dāng)肽質(zhì)量濃度達(dá)到0.5 g/L和1 g/L時，相同時間點，雄性果蠅的存活率有了明顯提高；由圖1（b）可以看出，相對于空白對照組雌性果蠅，喂食質(zhì)量濃度為0.5 g/L和1 g/L時，在相同時間點，雌性果蠅的存活率有所提高，但結(jié)果差異不明顯。

圖1 不同質(zhì)量濃度的QEPV對果蠅存活率的影響

由表1可以看出，相對于空白對照組，低劑量組雄性果蠅平均壽命沒有明顯變化，但中劑量組和高級量組雄性果蠅平均壽命均有提高，分別為15.44%和9%，但僅中劑量組產(chǎn)生了顯著性差異（P＜0.05），說明中劑量組雄性果蠅的平均壽命顯著性提高。同時，中劑量組和高劑量組果蠅的半數(shù)死亡時間得到了提高，但最長壽命方面均未有明顯差異。

表1 QEPV對雄性果蠅壽命的影響

表2 QEPV對雌性果蠅壽命的影響

由表2可以看出，雌性果蠅低劑量組、中劑量組和高劑量組在平均壽命方面均有所提高，但均未產(chǎn)生顯著性差異。但中劑量組和高劑量組的最長壽命均有所提高，較空白對照組分別延長7和6，并產(chǎn)生了顯著性差異（P＜0.05）。Yuneva等[21]研究發(fā)現(xiàn)，一定濃度的肌肽能夠顯著提高果蠅平均壽命，但當(dāng)質(zhì)量濃度更高時，果蠅的平均壽命并沒有顯著性增加。Kyu-Sun Lee[22]等在對姜黃素延長果蠅的壽命實驗中也同樣發(fā)現(xiàn)，果蠅壽命延長與所用姜黃素濃度以及果蠅品系、性別等有著密切關(guān)系。Hyung-Lyun Kang[23]等也發(fā)現(xiàn)果蠅壽命延長與受試藥物濃度、受試果蠅品系有關(guān)。本實驗結(jié)果說明，生物活性多肽QEPV在一定濃度下可以提高果蠅的平均壽命和最長壽命，但與濃度和性別有關(guān)。這種與受試物濃度、品系相關(guān)的現(xiàn)象可能是因為QEPV參與果蠅的部分生物代謝，或者是通過改善果蠅組織的抗氧化體系來達(dá)到延長果蠅壽命的效果。由于不同品系果蠅的代謝會有區(qū)別，從而造成結(jié)果的差異。而性別的差異，可能是由于雌性果蠅本身就具有一定的保守性和對外界環(huán)境的抵抗力，所以QEPV對雌性果蠅壽命延長并不明顯，Yuneva等[21]人的研究也發(fā)現(xiàn)，肌肽僅延長了雄性果蠅壽命，而雌性果蠅未出現(xiàn)顯著性差異，這也說明雌性果蠅對外界刺激的抵抗力高于雄性。本研究中雌性果蠅空白對照組與雄性果蠅空白對照組之間的平均壽命差異也證明了這一結(jié)論。

2.2 繁殖力測定實驗結(jié)果

生物體在維持機體正常機能和繁衍后代過程中都需要消耗能量及物質(zhì)，兩者之間存在相互競爭的關(guān)系，而壽命長短則是這兩者平衡后的結(jié)果。Partridge[24]等曾報道生殖和壽命經(jīng)常呈負(fù)相關(guān)，且在實驗室條件下，通過抑制生育率可以提高壽命。Jagan[25]等也曾證明線蟲生命周期與相互交疊的小分子調(diào)控有著密切聯(lián)系，同時也說明，對于很多生物，生殖能力與機體壽命長短的變化是呈負(fù)相關(guān)的。為了驗證實驗中果蠅壽命延長是QEPV直接作用結(jié)果還是QEPV誘導(dǎo)產(chǎn)生的二級生理效應(yīng)所導(dǎo)致的，因此進(jìn)行了果蠅的繁殖力實驗。

表3 繁殖力測定實驗結(jié)果

由表3可以看出，低濃度實驗組繁殖力與對照組相比未產(chǎn)生顯著性變化，但中劑量實驗組和高劑量實驗組果蠅的繁殖力與空白對照組相比有顯著提高（P＜0.05）。說明一定濃度的QEPV能夠促進(jìn)果蠅的繁殖力。Minou[26]等曾利用果蠅模型來研究繁殖力與長壽之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在果蠅模型中，果蠅的繁殖力與長壽是有拮抗作用的。本實驗結(jié)果表明，果蠅壽命的延長是QEPV直接作用的結(jié)果，而非QEPV通過降低繁殖力所產(chǎn)生的二級生理效應(yīng)。同時也說明QEPV對果蠅是安全的，沒有毒性危害。

2.3 過氧化氫急性毒性實驗結(jié)果

圖2 過氧化氫（H2O2）急性實驗

長壽的機體一般來說可以抵抗饑餓、氧化、各種環(huán)境壓力。過氧化氫產(chǎn)生的羥自由基是一種化學(xué)性質(zhì)最活潑的活性氧，可以造成蛋白質(zhì)產(chǎn)生損傷、DNA突變、引起脂質(zhì)過氧化，并且會造成許多生物分子、細(xì)胞、組織的氧化損傷[27]。羥自由基在體內(nèi)會普遍且迅速的通過提取氫、加成或電子轉(zhuǎn)移方式與諸多物質(zhì)或組織進(jìn)行反應(yīng)，具有破壞性強、非特異性、反應(yīng)迅速等特點[28]。為了評估生物活性多肽QEPV是否能夠提高果蠅對外界環(huán)境中過氧化物的抵抗力，我們進(jìn)行了過氧化氫急性毒性實驗。從圖2（a）中可以看出，對于雄性果蠅，經(jīng)過QEPV喂食后，在各個時間點，雄性果蠅的存活率均高于未經(jīng)QEPV喂食的果蠅，且存活時間較空白對照組有所提高，說明喂食QEPV后，雄性果蠅抗氧化能力有所提高。圖2（b）中，喂食QEPV的雌性果蠅，在高濃度的過氧化氫環(huán)境中15h內(nèi)存活率明顯高與對照組，說明這段時間雌性果蠅抗氧化能力有所提高。但后期實驗組和對照組存活曲線基本重合，說明喂食QEPV的雌性果蠅的抗氧化能力逐漸減弱，經(jīng)過一定時間后與對照組沒有差異。此實驗結(jié)果表明，QEPV可以提高果蠅的抗氧化能力。這與已經(jīng)報道的QEPV抗氧化能力實驗結(jié)果一致[29]。

過氧化氫酶是動物在進(jìn)化過程中形成的抗氧化酶體系的重要一員[30]，其可以很好地清除生物體在呼吸過程中產(chǎn)生的H2O2。李津[31]等報道紫甘薯提取物可以通過調(diào)節(jié)過氧化氫酶來抑制H2O2產(chǎn)生的氧化損傷，從而提高果蠅的壽命。根據(jù)H2O2急性毒性實驗結(jié)果，可以推測QEPV可能通過調(diào)節(jié)CAT活性來提高果蠅對H2O2損傷的抵抗能力。

2.4 果蠅SOD活性和MDA含量測定結(jié)果

表4 QEPV對果蠅SOD、MDA的影響

SOD是生物體內(nèi)一種非常重要的清除超氧自由基的酶，它可以將超氧自由基轉(zhuǎn)換為過氧化氫，進(jìn)而利用過氧化氫酶和過氧化物酶將過氧化氫分解，從而形成抗氧化的鏈。同時，生物體內(nèi)產(chǎn)生的自由基會攻擊脂質(zhì)，使其發(fā)生過氧化，從而產(chǎn)生MDA，最終對其他物質(zhì)產(chǎn)生損傷，造成機體衰老。因此，通過測定果蠅體內(nèi)SOD和MDA濃度可以判斷物質(zhì)的抗氧化能力[32]。

由表4中可以看出，相對于空白對照組，小肽處理組雌雄果蠅體內(nèi)的SOD含量均有提高，且對于雄性果蠅組而言，在肽質(zhì)量濃度達(dá)到1 g/L時，果蠅體內(nèi)的SOD含量出現(xiàn)顯著性差異，而雌性果蠅組則在肽質(zhì)量濃度為0.5 g/L和1 g/L時出現(xiàn)顯著差異。說明通過攝入一定的小肽，可以提高體內(nèi)的SOD含量，并幫助機體保護自身防止氧化損傷。

在SOD的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討果蠅體內(nèi)MDA濃度，由表4可以看出，實驗組雄性果蠅和雌性果蠅體內(nèi)的MDA濃度均有降低。相對于雄性空白對照組MDA濃度（1.37±0.21）μmol/L，質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL和1 mg/mL果蠅組的MDA濃度出現(xiàn)顯著性的降低，而雌性果蠅組中，在1 mg/mL質(zhì)量濃度肽處理時，果蠅體內(nèi)的MDA濃度出現(xiàn)顯著性的降低。由于MDA是體內(nèi)脂質(zhì)過氧化而生成的，其濃度的降低間接地說明果蠅的抗氧化酶系活力得到了提高，從而保護機體組織器官不會產(chǎn)生大量脂質(zhì)過氧化物。

從實驗結(jié)果可以看出，SOD和MDA的實驗結(jié)果相互佐證，可以說明小肽有助于提高機體體內(nèi)的抗氧化酶系的活力，從而能有效提高機體的抗氧化能力，減少機體受不良因子的刺激，從而降低機體老化、衰老和生病機率；總體來看，對于雄性果蠅的作用要好于雌性果蠅。

3 結(jié)束語

通過對果蠅生命時間、抗氧化生理生化指標(biāo)、繁殖能力變化等指標(biāo)的研究，從清除氧自由基的角度探討了乳源性小肽QEPV抗氧化和抗衰老的效果及機理。實驗結(jié)果表明，一定量的乳源性小肽QEPV可以提高果蠅壽命，并可以通過提高果蠅體內(nèi)抗過氧化酶系的活力，增強機體抵抗外源性氧化刺激的功能，降低機體組織中過氧化物的產(chǎn)生來延緩果蠅的衰老，這些結(jié)果將QEPV清除自由基和抗氧化、抗衰老功能從機理上統(tǒng)一了起來。實驗結(jié)果中，QEPV的抗衰老作用并沒有隨著濃度的提高而增大，這一現(xiàn)象在很多抗氧化、抗衰老藥物中也存在，可能原因是QEPV的飼喂時間長，其被果蠅吸收利用量是有一定限制的，且作用效果溫和而緩慢；同時衰老是一個極其復(fù)雜的過程，自由基學(xué)說只能部分解釋衰老過程，QEPV可能也會通過參與機體生物代謝來實現(xiàn)抗衰老，這可能造成了只有適宜的濃度下，果蠅的壽命延長最大。QEPV具體的抗氧化與抗衰老機制有待進(jìn)一步研究。

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