劉 霏，李浩然， 程 璽，李夢嬌，王子良，楊 莉

1.復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院婦科，復旦大學上海醫(yī)學院腫瘤學系，上海 200032；

2.復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所，復旦大學上海醫(yī)學院腫瘤學系，上海 200032；

3.浙江省腫瘤醫(yī)院婦科，浙江 杭州 310002

蟾蜍靈對宮頸癌細胞的增殖抑制作用及其機制研究

劉 霏1，李浩然1， 程 璽1，李夢嬌1，王子良2，楊 莉3

1.復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院婦科，復旦大學上海醫(yī)學院腫瘤學系，上海 200032；

2.復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所，復旦大學上海醫(yī)學院腫瘤學系，上海 200032；

3.浙江省腫瘤醫(yī)院婦科，浙江 杭州 310002

背景與目的：宮頸癌仍然是婦科腫瘤致死病因的第二位，部分原因為化療耐藥。蟾蜍靈是傳統(tǒng)中藥蟾酥的成分之一，目前在國內(nèi)廣泛應(yīng)用于腫瘤的治療中。該研究旨在探討蟾蜍靈對宮頸癌細胞ME180和C33A的增殖抑制作用及相關(guān)機制。方法：采用CCK8(cell counting kit-8)法檢測蟾蜍靈對宮頸癌細胞增殖的抑制作用，采用葡萄糖檢測分析試劑盒(glucose assay kit)進行細胞內(nèi)糖代謝檢測分析，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)檢測細胞內(nèi)葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1(glucose transporter 1，GLUT1)和己糖激酶2(hexokinase 2，HK2)的mRNA的表達水平，采用蛋白［質(zhì)］印跡法(Western blot)檢測原癌基因C-MYC和缺氧誘導因子1α(Hif-1α)表達的變化。結(jié)果：CCK8法結(jié)果顯示，蟾蜍靈能明顯抑制宮頸癌細胞ME180和C33A細胞增殖(P=0.027，P=0.018)。糖代謝檢測結(jié)果顯示，蟾蜍靈處理組葡萄糖代謝水平顯著降低(P=0.034，P=0.036)。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，蟾蜍靈處理組糖代謝相關(guān)指標GLUT1(P=0.019，P=0.016)和HK2(P=0.039，P=0.041)的表達水平明顯下調(diào)。Western blot檢測結(jié)果顯示，蟾蜍靈處理后宮頸癌細胞內(nèi)C-MYC和Hif-1α蛋白表達水平顯著下調(diào)。結(jié)論：蟾蜍靈可以通過降低宮頸癌細胞ME180和C33A糖代謝水平，從而抑制細胞增殖。

蟾蜍靈；宮頸癌；細胞增殖；葡萄糖代謝

2008年全球有28.7萬例患者死于宮頸癌，據(jù)估計，2030年死于宮頸癌的患者將升至41萬［1］。臨床上復發(fā)或遠處轉(zhuǎn)移的宮頸癌患者，難以進行再次手術(shù)或放療，常規(guī)的治療方法為化療，而化療耐藥和化療藥物不良反應(yīng)不能耐受仍然是比較嚴峻的問題［2］。因此，尋找新的治療藥物迫在眉睫。不同于正常細胞，腫瘤細胞主要通過有氧糖酵解獲得能量［3-4］。糖酵解途徑(glycolytic pathway)能夠快速產(chǎn)生ATP，有效地為細胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移提供能量［5］。Hanahan等［3］認為，這種特殊的糖代謝方式能夠使腫瘤細胞與正常細胞在競爭能量時占據(jù)優(yōu)勢地位。近年來，不少研究表明抑制腫瘤細胞糖代謝，不僅能導致腫瘤細胞能量耗竭，而且阻礙其合成快速增殖所需的物質(zhì)，最終達到抑制腫瘤細胞增殖的目的［6］。Knouzy等［7］研究發(fā)現(xiàn)，異環(huán)磷酰胺的代謝產(chǎn)物氯乙醛可以體外抑制乳腺癌細胞MCF-7的糖代謝，進而抑制其增殖。蟾蜍靈是傳統(tǒng)中藥蟾酥的主要活性成分之一，具有良好的抗腫瘤作用［8-10］，并且，相對于傳統(tǒng)的化療藥物，蟾蜍靈的不良反應(yīng)較?。?1］。目前研究發(fā)現(xiàn)，蟾蜍靈對腫瘤具有抑制細胞Na+-K+-ATP酶、阻滯細胞周期、促進細胞凋亡、誘導細胞分化等功能，而這些功能與細胞的代謝密切相關(guān)，而蟾蜍靈對腫瘤細胞糖代謝的影響鮮見報道。因此本研究從代謝的角度，應(yīng)用蟾蜍靈作用于宮頸癌細胞ME180和C33A，分析蟾蜍靈對宮頸癌細胞糖代謝的影響，探討蟾蜍靈抑制宮頸癌細胞增殖的可能機制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

人宮頸癌細胞系ME180和C33A購自美國ATCC(American type culture collection)公司。高糖DMEM培 養(yǎng) 基 、0.25% Trypsin-EDTA、1×PBS購自美國Hyclone公司。胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自美國Gibco公司。蟾蜍靈購自美國Sigma-Aldrich公司。CCK8(cell counting kit-8)購自日本Dojindo Molecular Technologies公司。葡萄糖檢測分析試劑盒(glucose assay kit)購自美國Biovision公司。內(nèi)參引物GAPDH及引物GLUT1、HK2由上海生物工程技術(shù)有限公司合成，引物序列見表1。Realtime PCR所用試劑均購自日本TaKaRa公司。蛋白［質(zhì)］印跡法(Western blot)所用抗體均購自中國Protein Tech生物公司。

表 1 目的基因的引物序列Tab. 1 Primers sequence of target genes

1.2 細胞培養(yǎng)

各種細胞均按照ATCC提供的標準方案進行培養(yǎng)，具體為用含有10% FBS，1%青-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，各細胞均在37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，應(yīng)用0.25%胰蛋白酶消化傳代。實驗所用細胞均為處于對數(shù)生長期細胞。

1.3 CCK8細胞增殖實驗

采用0.025、0.05、0.1和0.2 μmol/L的蟾蜍靈處理宮頸癌細胞ME180和C33A 48 h后檢測其增殖抑制情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低于0.1 μmol/L的蟾蜍靈對宮頸癌細胞抑制作用不明顯，而高于0.1 μmol/L的蟾蜍靈對宮頸癌細胞毒性過大，均

不利于后續(xù)實驗檢測。因此選用0.1 μmol/L的蟾蜍靈進行后續(xù)實驗。0.1 μmol/L的蟾蜍靈處理宮頸癌細胞ME180和C33A 48 h后，計數(shù)稀釋至104個/mL，接種于96孔板中，每孔加入100 μL細胞懸液即1 000個活細胞，同時接種相同數(shù)量未處理的宮頸癌細胞作為對照組。設(shè)3個復孔，并設(shè)置空白對照。置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔24 h在450 nm測定吸光度(D)值。以上實驗重復3次。繪制細胞增殖曲線。

1.4 葡萄糖代謝檢測

采用特制葡萄糖代謝檢測專用96孔板，每孔70 μL培養(yǎng)基，每孔種細胞數(shù)3×104個，置于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的細胞培養(yǎng)箱過夜，按照glucose assay kit說明書檢測葡萄糖含量，計算分析細胞的糖攝取水平。

1.5 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRTPCR)檢測

反應(yīng)液配制按照日本TaKaRa公司SYBR Premix Ex TaqTMⅡ說明書進行操作(GAPDH作為內(nèi)參)。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，58 ℃退火30 s，40個循環(huán)。數(shù)據(jù)分析采用2-△△Ct法，所有qRT-PCR實驗重復3次，每次設(shè)置3個復孔。

1.6 Western blot檢測

同時收集0.1 μmol/L蟾蜍靈處理48 h以及對照組細胞沉淀，加入裂解液及蛋白酶抑制劑裂解細胞，抽提蛋白定量3 μg/μL后上樣于SDSPAGE中電泳，電泳結(jié)束后將蛋白恒壓濕轉(zhuǎn)至0.2 μm PVDF膜上，8%的脫脂牛奶封閉1h，一抗4 ℃溫育過夜，TBST洗膜3次，加入二抗室溫溫育2 h，TBST洗膜3次后化學發(fā)光法進行目的蛋白條帶顯色。

1.7 統(tǒng)計學處理

所有實驗均重復3次以上。采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，所有數(shù)據(jù)均以表示。計量資料的比較采用方差分析和t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 蟾蜍靈對宮頸癌細胞增殖的影響

CCK8檢測結(jié)果顯示，蟾蜍靈處理組宮頸癌細胞ME180和C33A的增殖明顯受到抑制，差異有統(tǒng)計學意義(圖1，P＜0.05)。以上結(jié)果表明，0.1 μmol/L的蟾蜍靈能夠明顯抑制宮頸癌細胞ME180和C33A的增殖。

2.2 蟾蜍靈對宮頸癌細胞糖代謝水平的影響

檢測蟾蜍靈處理前后宮頸癌細胞ME180和C33A葡萄糖攝取的情況。結(jié)果顯示，與對照組相比，處理組的宮頸癌細胞葡萄糖攝取水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(圖2，P＜0.05)。上述結(jié)果表明，蟾蜍靈可能通過降低宮頸癌細胞ME180和C33A的糖代謝水平，從而抑制宮頸癌細胞的增殖。為進一步研究蟾蜍靈調(diào)節(jié)宮

頸癌細胞糖代謝的機制，采用qRT-PCR法對葡萄糖轉(zhuǎn)運體GLUT1和己糖激酶HK2進行檢測。結(jié)果顯示，與對照組相比，蟾蜍靈處理組的GLUT1和HK2表達水平明顯下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義(圖3，P＜0.05)。

圖 1 蟾蜍靈可抑制宮頸癌細胞ME180(A)和C33A(B)增殖Fig. 1 Bufalin can inhibit the proliferation of cervical carcinoma cells ME180(A) and C33A(B)

圖 2 蟾蜍靈可降低宮頸癌細胞葡萄糖攝取水平Fig. 2 Bufalin can decrease glucose uptake in cervical carcinoma cells

2.3 C-MYC和HIF1α可能是蟾蜍靈潛在的作用靶點

采用Western blot檢測對照組和蟾蜍靈處理組細胞的C-MYC和HIF1α蛋白表達水平，結(jié)果表明，與對照組相比，蟾蜍靈處理組細胞內(nèi)C-MYC和HIF1α蛋白表達水平明顯降低(圖4)。

圖 3 糖代謝相關(guān)基因GLUT1和HK2的表達Fig. 3 Expression of glucose metabolism-related genes GLUT1 and HK2

圖 4 蟾蜍靈可抑制C-MYC和HIF1α蛋白表達Fig. 4 Expression of C - MYC and HIF1α was down-regulated with bufalin treatment

3 討 論

蟾蜍靈對腫瘤細胞的增殖抑制作用在肝癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌及白血病等多種腫瘤中均有報道，主要通過阻滯細胞周期［15-16］、干擾或激活MRPKs家族主要通路［17］、下調(diào)TS蛋白、降低拓撲異構(gòu)酶Ⅱ水平及活性等機制抑制腫瘤細胞增殖［18］。本研究中首次發(fā)現(xiàn)蟾蜍靈可以通過抑制宮頸癌細胞糖代謝從而抑制細胞增殖。

腫瘤細胞中異常高表達的C-MYC和HIF1α在糖酵解中起到至關(guān)重要的作用［19］。目前研究發(fā)現(xiàn)，C-MYC和HIF1α是主要的促進糖酵解的轉(zhuǎn)錄因子［12-14］。C-MYC能夠通過上調(diào)GLUT1等葡萄糖轉(zhuǎn)運體的表達，促進腫瘤細胞主動攝取葡萄糖［20］。Liu等［21］研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用GLUT1的抑制劑WZB117在體內(nèi)外均可以明顯抑制肺癌和乳腺癌細胞增殖。既往一些臨床前期研究表明，抑制HIF1α活性對腫瘤的生長抑制有顯著效果［22］。HIF1α可調(diào)控一系列靶基因如葡萄糖轉(zhuǎn)運因子GLUT1、GLUT3，糖酵解酶LDHA、HK等的轉(zhuǎn)錄，與腫瘤糖代謝及增殖密切相關(guān)［23］。C-MYC和HIF1α兩者可協(xié)同激活HK2，而HK2可通過磷酸化將細胞內(nèi)的葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖-6-磷酸，后者不是葡萄糖轉(zhuǎn)運體的底物，因而使葡萄糖在腫瘤細胞內(nèi)的保留增加，進而促進Warburg效應(yīng)［20,24］。

在本研究中，CCK8法結(jié)果顯示，蟾蜍靈能夠明顯抑制宮頸癌細胞ME180和C33A增殖；糖

代謝檢測發(fā)現(xiàn)，經(jīng)蟾蜍靈處理后，宮頸癌細胞的葡萄糖攝取水平明顯降低；而qRT-PCR結(jié)果顯示，分別與細胞主動攝取葡萄糖以及增加葡萄糖保留直接相關(guān)的GLUT1和HK2表達水平，蟾蜍靈處理組明顯低于對照組；Western blot結(jié)果表明，蟾蜍靈能夠降低細胞內(nèi)糖酵解的主要轉(zhuǎn)錄因子C-MYC和HIF1α的表達水平，進而影響下游與糖酵解相關(guān)的葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白以及關(guān)鍵酶的表達或激活。糖酵解的抑制使得細胞快速增殖所需的能量不足和物質(zhì)合成受阻，最終達到抑制宮頸癌細胞增殖的目的。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)蟾蜍靈能夠抑制宮頸癌細胞ME180和C33A增殖，其機制可能是通過下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子C-MYC和HIF1α的表達，降低葡萄糖轉(zhuǎn)運體GLUT1表達和己糖激酶HK2的激活，進而降低了細胞的糖酵解水平，最終達到抑制其增殖的目的，蟾蜍靈是否在體內(nèi)研究中也有類似的作用，還需進一步研究探索。

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Research on the cytostatic effect of bufalin on cervical carcinoma cells and the related mechanism

LIU Fei1, LI Haoran1, CHENG Xi1, LI Mengjiao1, WANG Ziliang2, YANG Li3(1.Department of Gynecological Oncology, Fudan University Shanghai Cancer Center, Department of Oncology, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 200032, China; 2. Department of Cancer Institute, Fudan University Shanghai Cancer Center, Shanghai 200032, China; 3.Department of Gynecological Oncology, Zhejiang Cancer Hospital, Hangzhou 310002, Zhejiang, China)

CHENG Xi E-mail: cheng_xi1@hotmail.com

Background and purpose: Cervical cancer remains the second leading cause of death in gynecologic malignancies partially because of resistance to chemotherapy. Bufalin, a component of the traditional Chinese medicine Chansu, has been widely used in cancer treatment in China. This study aimed to investigate the effects of bufalin on inhibiting the proliferation of ME180 and C33A and explore its possible mechanism. Methods: The cytostatic effects of bufalin on ME180 and C33A cells were evaluated by CCK8 assay (cell counting kit-8). Glucose levels in ME180 and C33A cells were measured using glucose assay kit. Then the alterations of GLUT1 (glucose transporter 1) and HK2 (hexokinase 2) gene expression were detected by quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR). The expressions of proto-oncogene C-MYC and HIF1α (hypoxia-inducible factor 1α) were determined by Western blot. Results: According to the results of CCK-8, bufalin can significantly inhibit the proliferation of carcinoma cells ME180 and C33A (P=0.027, P=0.018). Test on glycometabolism indicated that glucose uptake in cells treated with bufalin decreased (P=0.034, P=0.036). Results from real-time PCR showed that

Bufalin; Cervical neoplasm; Cellular proliferation; Glucose metabolism

10.3969/j.issn.1007-3969.2015.10.004

R737.33

A

1007-3639(2015)10-0780-05

2015-03-25

2015-05-19）

國家自然科學基金青年科學基金項目(NSFC1212)；上海市衛(wèi)生局中醫(yī)藥科研基金(WS-ZY1201)。

程 璽 E-mail:cheng_xi1@hotmail.com

the expression of glycometabolism related indicators GLUT1 (P=0.019) and HK2 (P=0.016) levels were significantly down-regulated in bufalin treated group. Western blot showed that the expression of C-MYC and HIF1αin cells with bufalin treatment was down-regulated markedly. Conclusion: Bufalin can inhibit the proliferation of the cervical carcinoma cells ME180 and C33A through inhibition of their glucose metabolism.