程顯祿， 黃琦磊，張建成

轉(zhuǎn)化生長因子-β1和阿托伐他汀對人心房成纖維細胞Ⅰ型膠原和Smads蛋白表達的影響

程顯祿， 黃琦磊，張建成

目的: 通過轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）和阿托伐他汀對培養(yǎng)的人心房成纖維細胞進行干預(yù)，觀察其Ⅰ型膠原，Smad2、Smad4和Smad7 mRNA及蛋白表達的變化，探討心房纖維化和抗纖維化機制。

方法: 通過心外科手術(shù)獲得患者右心耳組織，并培養(yǎng)出人心房成纖維細胞；將細胞傳代培養(yǎng)，應(yīng)用四唑鹽比色（MTT）法檢測不同濃度（0、0.1、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0 ng/ml）TGF-β1和不同濃度（0、0.1、1.0、10.0、100.0 μmol/L）阿托伐他汀對心房成纖維細胞生長影響；應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）和蛋白免疫印跡雜交（Western blot）技術(shù)檢測10.0 ng/ml TGF-β1、10.0 μmol/L阿托伐他汀以及10.0 ng/ml TGF-β1+10.0 μmol/L阿托伐他汀聯(lián)合對心房成纖維細胞中Ⅰ型膠原，P-Smad2，Smad4和Smad7 mRNA和蛋白表達的變化。

結(jié)果: MTT法檢測示：與對照（0 ng/ml）比，1.0 ng/ml 和10.0 ng/ml TGF-β1干預(yù)使心房成纖維細胞Ⅰ型膠原、P-Smad2、Smad4的mRNA和蛋白表達水平增高（P＜0.05），而Smad7的mRNA和蛋白表達水平減低（P＜0.05），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；與10.0 ng/ml TGF-β1相比，TGF-β1加用或單用阿托伐他汀（10.0 μmol/L）心房成纖維細胞Ⅰ型膠原、P-Smad2、Smad4的mRNA和蛋白表達水平減低（P＜0.05），而Smad7 mRNA和蛋白表達水平增高（P＜0.05），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)論： TGF-β1促進心房成纖維細胞增殖和Ⅰ型膠原表達，阿托伐他汀抑制其增殖和Ⅰ型膠原表達，可能是通過影響TGF-β1/Smads途徑起作用。

心血管病學(xué)；心房顫動；心房成纖維細胞；轉(zhuǎn)化生長因子-β1；Smads蛋白；阿托伐他汀

Methods: Human right atrial appendage tissue was obtained from the cardiac surgery in our hospital and the atrial fibroblasts were isolated and cultured by generations. The effects of TGF-β1 and atorvastatin on atrial fibroblast proliferation was detected by MTT method and the effect of TGF-β1 at (0, 0.1, 1.0, 5.0, 10.0, 20.0, 50.0) ng/ml and atorvastatin at (0, 0.1, 1.0, 10.0, 100.0) μmol/L on mRNA and protein expressions of collagen type I P-Smad2, Smad4 and Smad7 in atrial fibroblasts were examined by RT-PCR and Western-blotting analysis respectively.

Results: MTT detection presented that compared to TGF-β1 at 0 ng/ml, with the intervention of TGF-β1 at (1 and 10) ng/ ml, the mRNA and protein expressions of collagen type I P-Smad2, Smad4 increased, P＜0.05 and the expressions of Smad7 decreased, P＜0.05. Compared to TGF-β1 at 10.0 ng/ml, with the intervention of TGF-β1 + atorvastatin at 10.0 μmol/L or with atorvastatin at 10.0 μmol/L alone, the mRNA and protein expressions of collagen type I P-Smad2, Smad4 decreased, P＜0.05

and expressions of Smad7 increased, P＜0.05.

Conclusion: TGF-β1 promotes human atrial fibroblast proliferation and collagen type I expression, while atorvastatin inhibits such proliferation and expression, the effect might be done by affecting TGF-β1/Smads pathway in human atrial fibroblasts.

(Chinese Circulation Journal, 2015,30:562.)

以往研究表明心房顫動（房顫）發(fā)生和維持的基礎(chǔ)是心房纖維化[1]。分子生物學(xué)研究亦表明，心房纖維化的中心環(huán)節(jié)是轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）[2]，并通過TGF-β1/Smads信號傳導(dǎo)通路使成纖維細胞增殖，膠原分泌增多，導(dǎo)致心房纖維化。Smad蛋白最早于果蠅中發(fā)現(xiàn)的Mad（Mothers against decapentaplegic）蛋白，而后又發(fā)現(xiàn)新桿狀線蟲體內(nèi)的蛋白SMA也有相同功能，因此Ruiz-Ortega等[3]建議將參與TGF-β1細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)的， 人和不同動物的相關(guān)信號蛋白統(tǒng)一命名為Smad信號蛋白家族，它是TGF-β1受體作用的直接底物，它是把配體與受體相互作用的信號由細胞質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)到細胞核中的中間分子；分3個亞家族：第一類調(diào)節(jié)型Smad蛋白，包括Smad2等，需要磷酸化才能被激活；第二類是共同調(diào)節(jié)型Smad蛋白，只有Smad4，它與磷酸化（P-）Smad2發(fā)生結(jié)合，參與TGF-β1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)；第三類是抑制型Smad蛋白，包括Smad7等，它的功能是阻斷Smad2被磷酸化，阻斷信號的傳導(dǎo)。另他汀類藥物除調(diào)脂作用外，還有抗纖維化作用[4]。因此，了解心房纖維化的發(fā)生的機制和防治心房纖維化對治療房顫有重要意義，筆者以人工合成TGF-β1誘導(dǎo)體外培養(yǎng)心房成纖維細胞的分化增殖和阿托伐他汀干預(yù)后，觀察心房成纖維細胞增殖，I型膠原mRNA和蛋白表達的變化，同時觀察P-Smad2，smad4，smad7 mRNA和蛋白表達變化，以探討TGF-β1和阿托伐他汀對心房纖維化影響及可能機制。

1 資料與方法

資料：經(jīng)醫(yī)院倫理委會員批準和患者家屬同意，心臟手術(shù)中在建立體外循環(huán)前，無菌下取右心耳組織塊，并培養(yǎng)出人心房成纖維細胞作為研究對象；TGF-β1（美國peprotech公司），3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）粉（上海華藍化學(xué)科技有限公司），二甲基亞砜（DMSO，上海紫一試劑廠），酶聯(lián)免疫檢測儀（南京德鐵）。

方法：按文獻[5]方法，運用組織塊法培養(yǎng)出人心房成纖維細胞， MTT法 檢測不同濃度TGF-β1（0、0.1、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0 ng/ml）和不同濃度阿托伐他?。?、0.1、1.0、10.0、100.0 μmol/L）對心房成纖維細胞增殖的濃度效應(yīng)，使細胞同步化，按實驗方案分別加入含TGF-β1和阿托伐他汀的5%胎牛血清DMEM高糖培養(yǎng)液；每個濃度設(shè)5個復(fù)孔，并設(shè)對照，每孔200 μl，培養(yǎng)48 h；以上藥物濃度為培養(yǎng)液中最終濃度。棄去原來的培養(yǎng)液，再加MTT的培養(yǎng)液，每孔加20 μl MTT溶液（5 mg/ml，即0.5% MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，每孔加入150 μl DMSO，置搖床上低速振蕩10 min，在酶聯(lián)免疫檢測儀吸光值490 nm處測量各孔的吸光值，每孔重復(fù)測吸光值3次，取均值。同時設(shè)置調(diào)零孔，對照孔。再根據(jù)MTT法結(jié)果提示，選擇合適藥物濃度觀察TGFβ1與阿托伐他汀聯(lián)合對人心房成纖維細胞的增殖效應(yīng)。

半定量逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR） 心房成纖維細胞培養(yǎng)到3～5代，使細胞同步化，按實驗分不同濃度方案分別加入藥物；藥物干預(yù)48 h后用Trizol一步法提取RNA，經(jīng)RNA質(zhì)量鑒定和完整性鑒定后進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：按照TOYOBO公司“Rever Tra-α-”試劑盒說明進行：逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：30℃ 10 min，42℃ 20 min，99℃ 5 min，4℃5 min，瞬間離心；cDNA產(chǎn)物放置-70℃低溫冰箱中保存；引物的設(shè)計和合成：Smad2（273 bp）:上游 5’TCCACCAGGCTGTAATCTGAAGA 3’，下游5’GACATGCTTGAGCAACGCACT 3’；Smad4（376 bp）:上游 5’GATTTGCGTCAGTGTCATCG 3'，下游 5' TGATAAGGTTAAGGGCCCCA 3'；Smad7（289 bp）：上游 5’GAGTCAGCTGGTGCAGAAGGT 3’，下游5’GCCCTTCACAAAGCTGATCTG 3’；I型膠原（347 bp）：上游 5’GGCGGCCAGGGCTCCGAC 3’，下游 5’AATTCCTGGTCTGGGTCACC 3；內(nèi)照GAPDH（451 bp）：上游 5’CCACAGTCCATGCCATCACT 3’，下游 5’TCCACCACCCTGTTGCTGTAG 3’； 引物由TaKaRa（日本）公司合成。 PCR反應(yīng)體系按

照TIANGEN公司的PCR MIX試劑盒說明進行配置。PCR反應(yīng)條件：PCR反應(yīng)體系于PCR管中混勻共25 μl，于PCR儀中進行PCR反應(yīng)，94℃預(yù)變性3 min，然后進行PCR循環(huán)，94℃變性30 s，退火30 s，不同的目標基因退火溫度分別為58℃[Smad2，Smad4，I型膠原，3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）]，57℃（Smad7），72℃延伸30 s，進行32次循環(huán)，結(jié)束前72℃延伸5 min。其中所有的目標基因均設(shè)置陰性對照，以去離子水代替cDNA產(chǎn)物進行的PCR反應(yīng)。電泳和圖像掃描：取各目的基因PCR產(chǎn)物3 μl和GAPDH 3 μl同時加入用2%瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)溴化乙錠染色，用凝膠成像系統(tǒng)掃描，將目的基因條帶與GAPDH灰度值對比，以兩者的比值表示目的基因相對表達含量。

蛋白免疫印跡雜交（Western blot）法：心肌成纖維細胞同步化，按實驗方案分別加入藥物干預(yù)，48 h后進行Western blot實驗。細胞蛋白提取后，存放于-70℃低溫冰箱中保存。將樣品沸水浴中煮5 min；經(jīng)SDS-PAGE電泳轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，室溫下封閉1 h，加一抗4℃過夜。兔抗人P-Smad2單克隆抗體（美國，SATANCRUZ），鼠抗人Smad4單克隆抗體（美國，Thermo scientific），兔抗人Smad7單克隆抗體（美國，SATANCRUZ），鼠抗人Ⅰ型膠原單克隆抗體（美國，Chemicon millipore），鼠抗人β肌動蛋白（β-actin）單克隆抗體（美國，SATANCRUZ）；轉(zhuǎn)膜完成后以下實驗按一步法免疫印跡試劑盒（UniversalTMOne-step Western Blot Kits）說明進行實驗。X光片感光顯影，凝膠成像系統(tǒng)測定蛋白樣品條帶的總灰度值。

2 結(jié)果

TGF-β1對人心房成纖維細胞增殖影響（表1）：TGF-β1對心房成纖維細胞生長增殖的最小有效濃度為1 ng/ml，且隨著TGF-β1濃度增加吸光度值也增加，與對照（0.0 ng/ml）相比，除0.1 ng/ml濃度外，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；在10 ng/ml、20 ng/ml、50 ng/ml三個濃度間比較促進心房成纖維細胞增殖的吸光度值有增加的趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），表明在細胞培養(yǎng)液中TGF-β1濃度為10 ng/ml時對體外培養(yǎng)的心房成纖維細胞達到了最大的增殖效應(yīng)。

阿托伐他汀對人心房成纖維細胞增殖影響（表1）：阿托伐他汀對心房成纖維細胞生長抑制最小有效濃度為1.0 μmol/L，隨阿托伐他汀濃度增加吸光度值在下降，和對照（0.0 μmol/L）相比除0.1 μmol/L外差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；濃度100.0 μmol/L比10.0 μmol/L 吸光度值低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），表明在細胞培養(yǎng)液中10.0 μmol/L阿托伐他汀對體外培養(yǎng)的人心房成纖維細胞的抑制作用達到最大的效應(yīng)。

表1 不同濃度TGF-β1、阿托伐他汀對人心房成纖維細胞增殖效應(yīng)的影響

表1 不同濃度TGF-β1、阿托伐他汀對人心房成纖維細胞增殖效應(yīng)的影響

注：TGF-β1：轉(zhuǎn)化生長因子-β1。兩種藥物和各自對照相比*P＜0.05。*心房成纖維細胞增殖效應(yīng)的吸光度值

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阿托伐他汀對TGF-β1誘導(dǎo)的人心房成纖維細胞增殖的影響（表2）：阿托伐他汀和TGF-β1不同濃度干預(yù)后和對照相比， 差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；10 μmol/L阿托伐他汀與10 ng/ml TGF-β1間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；10 ng/mlTGF-β1+10 μmol/L阿托伐他汀聯(lián)合干預(yù)后與單純10 μmol/L阿托伐他汀及單純10 ng/ml TGF-β1比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），說明阿托伐他汀可部分對抗TGF-β1對人心房成纖維細胞的增殖效應(yīng)。

表2 阿托伐他汀對TGF-β1誘導(dǎo)的人心房成纖維細胞增殖的影響

表2 阿托伐他汀對TGF-β1誘導(dǎo)的人心房成纖維細胞增殖的影響

注：與對照相比*P＜0.05 ；與10 ng/ml TGF-β1相比△P＜0.05 ；與10μmol/L阿托伐他汀及10 ng/ml TGF-β1比▲P＜0.05?？s略語注釋見表1

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TGFβ1和阿托伐他汀對人心房成纖維細胞P-Smad2，Smad4，Smad7和Ⅰ型膠原mRNA水平的影響（圖1A～1D、表3）：與對照（0）比，不同藥物濃度TGF-β1及阿托伐他汀干預(yù)后P-Smad2、Smad4、Smad7、Ⅰ型膠原mRNA差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）；與10 ng/ml TGF-β1相比10 ng/ml TGF-β 1+10μmol/L阿托伐他汀及10 μmol/L阿托伐他汀干預(yù)后P-Smad2、Smad4、Smad7和Ⅰ型膠原的mRNA差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。

Western blot 分析TGF-β1和阿托伐他汀對人心房成纖維細胞P-Smad2，Smad4，Smad7和Ⅰ型膠原蛋白水平的影響（表4和圖2）。

圖1 不同藥物濃度人心房成纖維細胞P-Smad2、Smad4、Smad7和Ⅰ型膠原mRNA表達的電泳圖

表3 TGF-β1和阿托伐他汀對人心房成纖維細胞P-Smad2、Smad4、Smad7和Ⅰ型膠原mRNA水平的影響

表3 TGF-β1和阿托伐他汀對人心房成纖維細胞P-Smad2、Smad4、Smad7和Ⅰ型膠原mRNA水平的影響

注：表中所列數(shù)據(jù)為內(nèi)參校正后mRNA灰度值。與對照相比*P＜0.05；與10 ng/ml TGFβ1比△P＜0.05。縮略語注釋見表1

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表4 TGF-β1和阿托伐他汀對人心房成纖維細胞P-Smad2、,Smad4、Smad7、Ⅰ型膠原蛋白水平的影響

表4 TGF-β1和阿托伐他汀對人心房成纖維細胞P-Smad2、,Smad4、Smad7、Ⅰ型膠原蛋白水平的影響

注：表中所列數(shù)據(jù)為內(nèi)參校正后蛋白吸光度值。與對照相比*P＜0.05；與10 ng/ml TGF-β1比△P＜0.05。縮略語注釋見表1

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圖2 不同藥物濃度對P-Smad2、Smad4、Smad7、Ⅰ型膠原蛋白免疫印跡雜交圖

與對照比，不同藥物濃度TGF-β1及阿托伐他汀干預(yù)后P-Smad2、Smad4、Smad7蛋白、Ⅰ型膠原蛋白表達水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）；與10 ng/ml TGF-β1相比，10 ng/ml TGF-β1+10 μmol/L阿托伐他汀及10 μmol/L阿托伐他汀干預(yù)后，P-Smad2、Smad4及Ⅰ型膠原吸光度值均降低，而Smad7吸光度值則升高，其蛋白表達水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。

3 討論

有研究認為房顫的發(fā)生、發(fā)展和維持與心房纖維化密切相關(guān)，心房纖維化主要是心房中Ⅰ型膠原mRNA轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)以及蛋白表達水平增加，最終導(dǎo)致心房中膠原比例失調(diào)，心房重構(gòu)[6]。

本研究表明，TGF-β1使人心房成纖維細胞中Ⅰ型膠原表達增高，這與Nakajima等[7]在實驗中發(fā)現(xiàn)，TGF-β1表達增加的小鼠心房纖維化加重的結(jié)果相似；在體外培養(yǎng)人心房成纖維細胞中，與Ⅰ型膠原mRNA和蛋白表達增高同時，P-Smad2，Smad4 mRNA以及蛋白表達也增高，然而Smad7 mRNA和蛋白表達卻減低；這與大鼠心梗組織中TGF-β1 mRNA增高時，P-Smad2和Smad4的mRNA在梗死組織亦增高，而Smad7的mRNA則減低結(jié)果相同[8]。實驗還發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀可部分拮抗TGF-β1誘導(dǎo)的人心房成纖維細胞增殖和Ⅰ型膠原表達的作用。且與對照相比，阿托伐他汀干預(yù)在Ⅰ型膠原mRNA和蛋白表達明顯降低的同時，P-Smad2，Smad4 mRNA以及蛋白表達也明顯減低；而Smad7的mRNA以及蛋白表達卻增高，這與Wang等[9]報道的使Smad7表達增加可使I型膠原的表達明顯受到抑制相一致；與 Martin等[10]在實驗中抑制TGF-β1信號傳導(dǎo)通路，使糖尿病大鼠心肌纖維化改善，并發(fā)現(xiàn)P-Smad2表達下降的結(jié)果相似。同時與另一研究提示，阿托伐他汀使高血壓大鼠的心室重構(gòu)改善是通過下調(diào)心肌P-Smad2、Smad4的mRNA和上調(diào)心肌Smad7的mRNA得已實現(xiàn)的結(jié)果相似[11]。

綜上所述，TGF-β1可能是通過TGF-β1/ Smads途徑，使膠原基因啟動子位點被激活，增加I型膠原蛋白的表達；阿托伐他汀可能是通過使TGF-β1/Smads途徑中的P-Smad2、Smad4表達減少，使Smad7表達增加，部分抑制人心房纖維化，防止房顫發(fā)生。

[1] 董麗君, 湯寶鵬, 周賢惠, 等. 心房肌基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制劑、凋亡相關(guān)基因表達改變與增齡性心房顫動關(guān)系的研究. 中國循環(huán)雜志, 2013, 28: 1034-1038.

[2] 吳鋼, 顧永偉, 程冕, 等. 血漿轉(zhuǎn)化生長因子β1水平與心房顫動導(dǎo)管消融后復(fù)發(fā)的關(guān)系研究. 中國循環(huán)雜志, 2013, 28: 41-43.

[3] Ruiz-Ortega M, Rodríguez-Vita J, Sanchez-Lopez E, et al. TGF-β signaling in vascular fibrosis . Cardiovasc Res, 2007, 74: 196 - 206.

[4] Jean Davignon . Beneficial Cardiovascular Pleiotropic Effects of Statins. Circulation, 2004, 109: 39-43.

[5] 張建成, 程顯祿, 黃宇堅, 等. 采用組織塊法培養(yǎng)心房顫動患者心房成纖維細胞. 中國心臟起搏與心電生理雜志, 2009, 23: 506-508.

[6] Jun Xu, Guanggen Cui, Fardad Esmailian, et a1. Atrial Extracellular Matrix Remodeling and the Maintenance of Atrial Fibrillation. Circulation, 2004, 109: 363-368.

[7] Nakajima H, Nakajima HO, Slacher O, et a1. Atrial but not ventircular fiborsis in mice expressing a mutant transforming growth factor-beta（1）transgene in the heart. Circ Res, 2000, 86: 571-579.

[8] 王嵐峰, 張蕾, 張瑞英, 等. Smad表達與心肌梗死后心室重構(gòu)的關(guān)系. 中華心血管病雜志, 2005, 33: 932-935.

[9] Wang B, Hao J, Jones SC, et al. Decreased Smad7 expression contributes to cardiac fibrosis in the infracted rat heart. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2002, 282: 1685-1696.

[10] Martin J, Kelly DJ, Mifsud SA , et al. Tranilast attenuates cardiac matrix deposition in experimental diabetes: role of transforming growth factor-beta. Cardiovasc Res, 2005, 65: 694-701.

[11] 譚安雄, 李金成, 粟順善, 等. 阿托伐他汀改善自發(fā)性高血壓大鼠心室重構(gòu)的機制. 中華高血壓雜志, 2007, 15: 497-500.

Effects of Transforming Growth Factor-β1 and Atorvastatin on the Expression of Collagen Type I P-Smads in Human Atrial Fibroblasts

CHENG Xian-lu, HUANG Qi-lei, ZHANG Jian-cheng.
Department of Cardiology, Nanping First Affiliated Hospital of Fujian Medical University, Nanping (353000), Fujian, China

Objective: To observe the effects of transforming growth factor-β1 (TGF-β1) and atorvastatin on expressions of collagen type I P-Smad2, Smad4 and Smad7 in human atrial fibroblasts, and to explore the fibrosis and anti-fibrosis mechanisms in human atrium.

Cardiology; Atrial fibrillation; Myocardial fibroblast; Transforming growth factor-β1; Smads protein; Atorvastatin

2014-09-24）

（編輯：常文靜）

353000 福建省南平市，福建醫(yī)科大學(xué)附屬南平第一醫(yī)院 心內(nèi)科（程顯祿、黃琦磊 ）；福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床學(xué)院（張建成）

程顯祿 副主任醫(yī)師 碩士 主要從事臨床心內(nèi)科工作 Email：wer_101@163.com

張建成 Email：fjzhangjiancheng@yahoo.com.cn

R54

A

1000-3614（2015）06-0562-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2015.06.013