石曉艷

（1.珠海市斗門生態(tài)農(nóng)業(yè)園管理委員會農(nóng)業(yè)科技推廣中心，珠海519100；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱150030）

甜菜nii基因編碼氨基酸偏好及與菠菜nii編碼蛋白序列的比較

石曉艷1，2

（1.珠海市斗門生態(tài)農(nóng)業(yè)園管理委員會農(nóng)業(yè)科技推廣中心，珠海519100；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱150030）

采用RT-PCR方法從二倍體甜菜Ty7中獲得與亞硝酸還原反應(yīng)相關(guān)的cDNA基因片段，運(yùn)用RACE技術(shù)獲得了基因全長序列，并命名為nii基因。該基因全長2014 bp，ORF長度1800 bp，編碼599個氨基酸。該基因編碼氨基酸殘基具有亮氨酸和纈氨酸偏好，編碼蛋白結(jié)構(gòu)域與菠菜的高度同源。該基因的獲得可為下一步基因的表達(dá)與調(diào)控研究奠定基礎(chǔ)。

甜菜；nii基因；氨基酸偏好；序列比較

銨態(tài)氮和硝態(tài)氮是植物生長所必需的氮源，甜菜的主要氮源為銨鹽和硝酸鹽。無機(jī)氮素以銨的形態(tài)參與代謝，非銨態(tài)的氮源被植物吸收后大都是先由植物將其轉(zhuǎn)化成NH4+，才可被甜菜直接利用合成氨基酸。甜菜根系吸收的硝酸鹽，必須在體內(nèi)經(jīng)過還原才能合成有機(jī)含氮化合物。硝酸鹽還原為NH4+，一般分兩步，先由硝酸還原酶（NR）還原成亞硝酸鹽，再由亞硝酸還原酶（NiR）還原為NH4+。

甜菜亞硝酸還原酶（NiR）由nii基因編碼，截至目前，至少已在擬南芥（Arabidopsis thaliana）[1-2]、煙草（Nicotiana tabacum L.）[3-4]、玉米（Zeamays L.）[5-6]、菠菜（Spinacia oleracea L.）[7-8]、水稻（Oryza sativa L.）[9]、豌豆（Pisum sativum L.）[10]、白菜（Brassica campestris L.）[11]等高等植物中克隆獲得了nii基因全長序列。本研究以二倍體甜菜Ty7為試材，克隆獲得甜菜nii基因，為后續(xù)的基因表達(dá)與調(diào)控研究奠定了基礎(chǔ)。

1　材料和方法

供試品種：甜菜品種為二倍體純系品種甜研7號（Ty7），種子由哈爾濱工業(yè)大學(xué)甜菜糖業(yè)研究所提供。

將甜菜種子在室溫下浸種過夜，置于培養(yǎng)皿中25℃恒溫催芽至少24h，然后移至營養(yǎng)缽中室內(nèi)培養(yǎng)，光照約1800 lx，溫度約為25℃。待幼苗長到2～4對真葉時就可用于試驗(yàn)。用前4h，向營養(yǎng)缽中澆灌30mmol/L的KNO3溶液，進(jìn)行氮光共同誘導(dǎo)培養(yǎng)，然后用于分子生物學(xué)操作。

根據(jù)GenBank上已知的甜菜nii的DNA部分序列（AF173663）與已知同屬藜科的菠菜nii mRNA（X07568）序列進(jìn)行比對后，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物，在保守區(qū)設(shè)計上游及下游引物，進(jìn)行兩端未知區(qū)域的擴(kuò)增。引物由上海生工公司和Invitrogen公司完成。設(shè)計的引物如表1。

RNA的提取參照Trizol（Invitrogen）的說明書進(jìn)行。取1μLRNA樣品與5μL 6×Loading Buffer混合后，于1%的瓊脂糖凝膠上電泳，檢測RNA的完整性。用DNaseⅠ消化RNA，去除殘存DNA。參照Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）反轉(zhuǎn)錄酶（TaKaRa）的使用說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，首先進(jìn)行中間序列的克隆，然后根據(jù)3＇-RACE試劑盒（TaKaRa）和5＇-RACE試劑盒（TaKaRa）使用說明書，進(jìn)行3＇端和5＇端的基因片段克隆，進(jìn)行序列拼接分析，得到拼接序列全長。

2　結(jié)果與分析

2.1nii基因編碼蛋白結(jié)構(gòu)域

根據(jù)以上方法，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增，獲得了423bp的中間序列，采用RACE技術(shù)克隆獲得了5＇端序列489bp，3＇端序列1600bp。采用序列拼接軟件將獲得的序列進(jìn)行拼接，得到了甜菜nii基因cDNA全序列2081bp，包括281 bp的3＇非翻譯區(qū)（UTR，untranslated region）和31bp的5＇非翻譯區(qū)；32bp處有啟始密碼子ATG，1832bp處有終止密碼子TAG，2003bp處是PolyA尾。

將克隆得到的nii基因序列，進(jìn)行ORF分析，發(fā)現(xiàn)編碼區(qū)全長為1800bp，共編碼599個氨基酸。圖1是甜菜nii基因編碼蛋白結(jié)構(gòu)域。所編碼的氨基酸序列具有完整NiR結(jié)構(gòu)，含血紅素蛋白β-化合物區(qū)域（hemoprotein beta-component,ferrodoxin-like,Domain:133～203 aa，392～461 aa），4Fe-4S區(qū)域（4Fe-4S region, Domain：211～371aa，517～580aa）。

圖1　nii基因編碼蛋白結(jié)構(gòu)域

2.2nii基因編碼氨基酸偏好

在nii cDNA編碼蛋白的氨基酸序列中，Leu（亮氨酸）和Val（纈氨酸）含量最多，比率分別為8.51%，然后是Glu（谷氨酸）占7.85%，位列第三的是Gly（甘氨酸）7.68%，Trp（色氨酸）和Tyr（酪氨酸）含量最少分別為1.34%（見表2）。編碼蛋白的氨基酸序列中含有13個Cys（半胱氨酸），說明編碼產(chǎn)物中可能含有二硫鍵。通過ExPASy的ProtParam工具分析，酸性氨基酸殘基總數(shù)（Asp+Glu）共78個，堿性氨基酸殘基總數(shù)（Arg+Lys）78個。

運(yùn)用在線分析軟件http://au.expasy.org/prosite/進(jìn)行活性位點(diǎn)分析，得出甜菜nii基因編碼蛋白序列的517～533區(qū)域的TGCpnsCgqvqvaDIGF為還原反應(yīng)的活性位點(diǎn)（見圖2）。

表2　nii編碼蛋白的氨基酸組成

圖2　甜菜nii基因編碼蛋白的活性位點(diǎn)分析

圖3　甜菜與菠菜的nii基因編碼蛋白序列比較

2.3與菠菜編碼蛋白結(jié)構(gòu)域的比較分析

為了分析比較甜菜（sugarbeet）與菠菜（spinach）nii基因的編碼蛋白，采用BioEdit分析軟件，對氨基酸序列進(jìn)行了比對，詳見圖3，從第13～55氨基酸，兩者出現(xiàn)了較大差異；分別在120～121aa；453～454aa；567～568aa三處有兩個氨基酸不同，但都不在功能區(qū)域內(nèi)；有1個氨基酸差異的分別位于第109、114、116、125、159、249、256、294、360、363、371、379、386、401、415、422、429、466、581、585的氨基酸位置。其中249、256、294、360、363、371處于4Fe-4S結(jié)構(gòu)域內(nèi)。

總體來看，甜菜nii基因編碼產(chǎn)物與同屬藜科菠菜的nii基因編碼的蛋白具有高度的同源性，兩基因編碼蛋白除了在各功能區(qū)域具有較高一致性外，在其它區(qū)域也有較大的相似性。這為進(jìn)一步分析甜菜nii基因的光養(yǎng)調(diào)控元件和NO3-調(diào)節(jié)的關(guān)鍵區(qū)提供了可能。

3　結(jié)論與討論

本研究采用RT-PCR技術(shù)和RACE技術(shù)，從二倍體甜菜甜研7號中克隆獲得甜菜nii基因，基因全長為1800bp，共編碼599個氨基酸。該基因具有亮氨酸和纈氨酸偏好，酸堿性氨基酸殘基總數(shù)基本相同。與菠菜nii基因的編碼蛋白具有高度同源性。

以往的研究結(jié)果證明，nii基因的硝化調(diào)節(jié)表達(dá)中，位于-230和-200區(qū)域之間30bp的基因是具有決定性的。根據(jù)文獻(xiàn)，菠菜nii的TATA盒位于5＇上游的-25，CAAT盒位于-80，在-200/+131是光、氮協(xié)同調(diào)控的基本元件，在-300/-200和-1450/-1730為兩個增強(qiáng)子區(qū)。在-230～220之間的30bp是菠菜nii基因NO3-調(diào)節(jié)的關(guān)鍵區(qū)。

菠菜葉片中Fd-NiR氨基酸的R375、R556、K436三個位點(diǎn)分別由Lys-5，磷酸吡啶醛（pyridoxal-5，-phosphate）和Arg-萘乙二醛（phenylglyoxal）修飾，以往的研究表明，這3個氨基酸或直接參與Fd結(jié)合，并將電子傳給NiR。當(dāng)植株處于氮饑餓時，甚至在NADPH/NADP的比率非常高的情況下，6-磷酸葡萄糖脫氫酶（G6PDH）也能作為NiR的電子供體使鐵氧還原酶（Fd）還原。關(guān)于甜菜nii基因的表達(dá)與調(diào)控的基本原件需要進(jìn)一步通過研究進(jìn)行分析和驗(yàn)證。

Kato等（2004）[3]的研究結(jié)果表明，煙草（tobacco）具有4個nii基因：nii-1，nii-2，nii-3，nii-4。通過定量競爭性RT-PCR揭示了煙草中該基因家族的差異性表達(dá)：在葉片及根中這4個基因各自的mRNA有些許區(qū)別。nii-1和nii-3的mRNA的穩(wěn)定狀態(tài)水平幾乎是相同的，這樣的結(jié)果也同樣表現(xiàn)在根中nii-2和nii-4的轉(zhuǎn)錄體中[3]。

關(guān)于甜菜的nii基因拷貝數(shù)是多少，其在不同部位的表達(dá)是否存在差異，需要進(jìn)一步開展研究探明。

[1]Hara,K.,Komaba,S.,Takahashi,M.,Goshima,N.and Morikawa,H.Arabidopsis thaliana nitrite reductasemRNA Published Only in Database[DB/OL].1997

[2]Lin,X.,Kaul,S.,Rounsley,S.,etal.Sequence and analysis of chromosome 2 of the plant Arabidopsis thaliana[J].Nature,1999,402 (6763):761-768

[3]Kato,C.,Takahashi,M.,Sakamoto,A.and Morikawa,H.Differential expression of the nitrite reductase gene family in tobacco as revealed by quantitative competitive RT-PCR[J].J.Exp.Bot.,2004,55(403):1761-1763

[4]Kronenberger,J.,Lepingle,A.,Caboche,M.and Vaucheret,H.Cloning and expression of distinctnitrite reductases in tobacco leaves and roots[J].Mol.Gen.Genet.,1993,236(2-3):203-208

[5]Margaret G,Redinbaugh,Wilbur H,Campbell.Glutamate synthasesand ferredoxin-dependent glutamate synthase expression in the maize(Zeamays)root primary response to nitrate[J].Plant physiol.,1993,101:1249-1255

[6]Lahners K,Kramer V,Back E,etal.Molecular cloning of complementary DNA encodingmaize nitrite reductase[J].Plant Physiol, 1988,88:741-746

[7]Back,E.,Burkhart,W.,Moyer,M.,Privalle,L.and Rothstein,S.Isolation of cDNA clones coding for spinach nitrite reductase: complete sequence and nitrate induction[J].Mol.Gen.Genet.,1988,212(1):20-26

[8]Back,E.,Dunne,W.,Schneiderbauer,A.,de Framond,A.,Rastogi,R.and Rothstein,S.J.Isolation of the spinach nitrite reductase gene promoterwhich confersnitrate inducibility on GUSgene expression in transgenic tobacco[J].PlantMol.Biol.,1991,17(1):9-18

[9]Dose M M,Hirasawa M,Kleis-SanFrancisco S,et al.The ferre-doxin-binding site of ferredoxin nitrite oxidoreductase differential chemicalmodification of the free enzyme and its comlex with ferredoxin[J].Plant Physiol,1997,114(3):1047-1053

[10]PolcynW,LucinskiR.Effectof N oxyanions on anaerobic induction of nitrite reductase in subcellular fraction of Bradyrhizobium sp.(Lupinus)[J].Antonie van Leeuwenhoek,2009,95:159-164.

[11]孫菲菲，蔣芳玲，侯喜林，李英，楊學(xué)東.白菜亞硝酸還原酶基因BcNiR的克隆及表達(dá)分析[J].園藝學(xué)報，2009，36（10）：1511-1518

Abstrct:In this study,a cDNA clone putatively associated with nitrite reduction was isolated from Ty7,a diploid cultivar of sugar beet(Beta vulgaris L.)using RT-PCR cloning technique.A novel full-length cDNA(GenBank accession number HQ224499),termed Bvnii,was obtained using rapid amplification of cDNA ends(RACE).Bvnii full length is 2014 bp.The open reading frame of this gene is 1800 bp in length,which encodes 599 amino acids. There are leucine,and valine preferences of amino acid residues encoded by Bvnii.The protein sequence of nii in sugar beet is highly homologous with that of spinach.This resultmay play a role in the further research on Bvnii gene expression and regulation.

Sugarbeet(Beta vulgaris L.)Nii Gene：Am ino Acid Preferences and Com parison with That of Spinach(Spinacia oleracea)

SHIXiao-yan1,2
（1.The Agricultural Technology Extension Center of Doumen Ecology-agriculture Zone Management Committee,Zhuhai519100; 2.College of Agronomy,Northeast Agricultural University,Harbin 150030）

sugarbeet;nii gene;amino acid preference;sequence comparison

S566.3；Q78

A

1007-2624（2015）04-0001-03

10.13570/j.cnki.scc.2015.04.001

2015-03-19

石曉艷，女，博士，珠海市斗門生態(tài)農(nóng)業(yè)園管理委員會農(nóng)業(yè)科技推廣中心職員，Email:317098196@qq.com