周穎麗，宋秀祖，洪為松，相文忠

雌二醇及中波紫外線在豚鼠皮膚色素沉著形成中的作用及其機(jī)制

周穎麗，宋秀祖，洪為松，相文忠

目的研究雌二醇和中波紫外線（UVB）輻射對豚鼠背部棕色皮膚中黑素代謝的影響，探討雌激素及UVB在皮膚色素沉著中的作用。方法選取健康花色豚鼠，設(shè)立溶媒對照組、UVB照射組、雌二醇處理組和雌二醇預(yù)處理后UVB照射組（雌二醇＋UVB組）；雌二醇濃度設(shè)為3.67×10－5、3.67×10－4、3.67×10－3mol／L；UVB照射劑量統(tǒng)一為500 mJ／cm2。采用皮膚在體共聚焦激光掃描顯微鏡（簡稱皮膚CT）以及透射電子顯微鏡等觀察雌二醇和UVB對黑素小體合成及降解的影響。結(jié)果①一定濃度雌二醇可加深豚鼠皮膚色素沉著，且隨著雌二醇濃度的遞增，沉著程度逐漸加深（P＜0.05）。②UVB照射組豚鼠皮膚色素沉著較未照射組明顯增加（P＜0.05）。③UVB細(xì)胞中自噬體增加，而雌二醇處理后自噬體減少。結(jié)論 雌二醇及UVB照射均可促進(jìn)豚鼠皮膚色素沉著，其機(jī)制可能與促進(jìn)黑素小體合成有關(guān)，黑素小體的降解異常也參與了豚鼠皮膚色素沉著的形成。

雌二醇；色素沉著；黑素小體；中波紫外線

黃褐斑等色素沉著性皮膚病是臨床上常見的皮膚病，引起皮膚色素沉著的原因有很多，且相當(dāng)復(fù)雜。其中紫外線照射（ultraviolet radiation，UV）、體內(nèi)性激素失調(diào)等與皮膚色素沉著密切相關(guān)。UV是造成皮膚色素沉著最為重要的外源性因素［1］。此外，雌激素也與色素沉著性疾病有著重要關(guān)系，是引起皮膚表面色素沉著的重要內(nèi)源性因素之一［2］。由于造成光損傷的UV波段主要包括長波紫外線（ultraviolet radiation A，UVA）和中波紫外線（ultraviolet radiation B，UVB），而UVB導(dǎo)致色素沉著的作用較UVA強(qiáng)，雌激素中雌二醇的生物學(xué)效應(yīng)最強(qiáng)，因此該研究UVB輻射和雌二醇對豚鼠背部棕色皮膚中黑素合成及降解的影響，探討雌激素及UV對皮膚色素代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 材料8只健康花色雌性豚鼠（背部皮膚棕色）購于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物研究中心，體重為（343±76）g，雌二醇購于美國Sigma公司，薇婷脫毛膏（敏感肌型）購于屈臣氏，紫外線光療儀SS-04B、UVB輻照度監(jiān)視器購自上海西格瑪公司，RT 300表面色度色差儀購于英國Lovibond公司，微維三維皮膚CT-Vivascope 1500購于美國Lucid Inc公司。透射電子顯微鏡來自浙江大學(xué)電鏡室。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物處理及分組 選擇豚鼠背部棕色毛發(fā)區(qū)，電動剃刀剃毛，取8個相離區(qū)域，分別設(shè)為溶媒對照組、雌二醇處理組（3.67×10－5、3.67× 10－4、3.67×10－3mol／L），UVB對照組、雌二醇（濃度同雌二醇處理組）聯(lián)合UVB照射組。豚鼠背部每隔2～3 d剃毛1次。

1.2.2 雌二醇及UVB照射處理 雌二醇用花生油配成3.67×10－5、3.67×10－4、3.67×10－3mol／L濃度4℃冰箱儲存，溶媒對照組采用純花生油。經(jīng)皮膚剃毛區(qū)，用棉簽棒混懸藥液后均勻涂抹于相應(yīng)部位，每天1次，連續(xù)涂抹。外涂雌二醇1周后，再次剃毛，必要時用脫毛膏處理，自制固定盒固定豚鼠，暴露需照光部位，用SS-04B型紫外線光療儀進(jìn)行UVB照射，調(diào)整光源與豚鼠皮膚的距離為15 cm，照射總量為500 mJ／cm2。照射前測定輻照度，UVB輻照劑量＝UVB輻照度×?xí)r間。照光后繼續(xù)外用雌二醇1周。

1.2.3 皮膚顏色的測定 分別在處理前后用RT 300表面色度色差儀測量豚鼠背部皮膚各區(qū)域的顏色。以L*a*b*值來衡量皮膚顏色的變化。本實驗主要觀察處理前后皮膚色素沉著的變化，故僅記錄L*值。L*值代表亮度，值為0～100，0表示黑色，100表示白色。

1.2.4 皮膚CT檢查 采用Vivascope 1500成像系統(tǒng)對經(jīng)過不同處理后的豚鼠皮膚進(jìn)行共聚焦掃描成像。皮膚CT光源為830 nm的激光，輸出功率介于0～16 mW，橫向分辨率2 μm，軸向分辨率1.6 μm，鏡頭與粘合窗之間介質(zhì)為超聲耦合劑，粘合窗與皮膚之間介質(zhì)為蒸餾水，掃描深度達(dá)350 μm。4%戊

巴比妥鈉腹腔注射麻醉豚鼠后，在欲行檢查區(qū)域，棉簽蘸水濕潤皮膚，調(diào)整鏡頭位置，對準(zhǔn)檢查部位皮膚，逐層向下掃描，拍照留存。

1.2.5 透射電子顯微鏡觀察 取皮膚CT檢查后同一處皮膚，常規(guī)取皮，在預(yù)冷2.5%戊二醛固定液中快速切分為大小約1 mm3的小皮塊，轉(zhuǎn)移至含固定液的EP管中，置4℃冰箱保存。棄去戊二醛廢液，磷酸緩沖液沖洗，1%鋨酸溶液再固定1～2 h，棄去鋨酸廢液，磷酸緩沖液沖洗后，常規(guī)梯度濃度酒精脫水，丙酮浸透，包埋劑包埋，聚合，超薄切片并染色。切片置入透射電子顯微鏡中，觀察表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中黑素小體及自噬體的超微結(jié)構(gòu)，拍照留存。1.3 統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，豚鼠各組皮膚顏色亮度值結(jié)果以±s表示，處理前后比較采用配對t檢驗，組內(nèi)及組間的兩兩比較采用兩獨立樣本t檢驗，處理前及處理后各組的皮膚顏色L*值比較采用方差分析，且P＜0.05時行SNK檢驗，檢驗水準(zhǔn)取P＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 豚鼠皮膚色素大體改變豚鼠背部皮膚外涂雌二醇混懸液，約5 d左右逐漸出現(xiàn)輕微色素沉著，以3.67×10－3mol／L的濃度為著。實行500 mJ／cm2的UVB照射后，約1 d左右照射部位出現(xiàn)肉眼可見的紅斑，第3天紅斑消退，表面皮膚干燥脫屑，5 d后脫屑減輕，開始出現(xiàn)色素沉著，7 d左右色素沉著逐漸穩(wěn)定。溶媒對照組及雌二醇3.67×10－5mol／L組膚色較前無明顯改變，3.67×10－4mol／L雌二醇組可見較明顯色素沉著，隨著雌二醇濃度的增加，色素沉著程度逐漸增加，UVB照射組較未照光組色素沉著程度明顯增加，結(jié)合不同濃度雌二醇處理后，色素沉著有不同程度的增加。見圖1。

2.2 皮膚顏色測定結(jié)果處理前各組間L*值無明顯差異，處理后3.67×10－4mol／L及3.67×10－3mol／L雌二醇組豚鼠皮膚色素沉著加深，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且3.67×10－3mol／L雌二醇處理組色素沉著程度高于3.67×10－4mol／L雌二醇處理組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；處理后溶媒對照組及3.67×10－5mol／L雌二醇組處理前后豚鼠皮膚顏色測定結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義。UVB照射組比未照射組豚鼠皮膚色素加深明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1、圖2。

2.3 豚鼠皮膚CT掃描后的影像特征一定濃度雌二醇及UVB照射處理后的區(qū)域與溶媒處理組相比，主要改變發(fā)生在表皮，表現(xiàn)為皮層色素含量的增加，黑素細(xì)胞數(shù)量的增多以及活躍程度的增強(qiáng)；而真皮的改變不如表皮明顯，主要表現(xiàn)為血管擴(kuò)張，而色素呈有或無增加。UVB照射處理后，表皮的改變十分明顯，表現(xiàn)為棘細(xì)胞層下部和基底層之間黑素顆粒的亮度和密度的明顯增加，圓形或橢圓形的明亮的黑素細(xì)胞及基底層呈樹枝狀結(jié)構(gòu)的黑素細(xì)胞（處于活躍增生狀態(tài)）的明顯增多，見圖3E。而一定濃度的雌二醇處理后，黑素顆粒和黑素細(xì)胞也有一定程度的增多，且隨著濃度的增加，該效應(yīng)增強(qiáng)，但較UVB的作用弱，見圖3B～3D。與此同時，雌二醇和UVB在致色素增多方面有一定的協(xié)同作用，見圖3F～3H。

2.4 透射電子顯微鏡下皮膚超微結(jié)構(gòu)特點透射電子顯微鏡下觀察豚鼠表皮角質(zhì)形成細(xì)胞，可清晰地見到細(xì)胞內(nèi)的線粒體、黑素小體、自噬泡等細(xì)胞器結(jié)構(gòu)。其中黑素小體呈致密深黑色的圓形或橢圓形顆粒樣結(jié)構(gòu)，大小不一，著色程度深淺不一，散在或成簇分布在細(xì)胞質(zhì)中。自噬泡呈雙層膜的空泡樣結(jié)構(gòu)，其內(nèi)可包含各種細(xì)胞器碎片，部分可能為黑素小體。見圖4。鏡下未能見到形態(tài)十分完整的黑素細(xì)胞，但可見充滿黑素小體的細(xì)胞突穿插于角質(zhì)形成細(xì)胞間。一定濃度雌二醇處理后，電鏡下角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)的黑素小體增多，而自噬泡減少，且隨著雌二醇濃度的增加，這種現(xiàn)象更明顯。UVB照射處理后，角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)的黑素小體和自噬泡均增加，黑素小體增加更明顯；與不同濃度雌二醇結(jié)合處理后，表現(xiàn)為黑素小體明顯增多，自噬泡在低濃度雌二醇組表現(xiàn)為增加，而高濃度雌二醇組表現(xiàn)為減少。說明UVB和雌二醇在致表皮色素沉著過程中有協(xié)同作用，可以導(dǎo)致黑素小體合成增加。雌二醇對角質(zhì)形成細(xì)胞的自噬有抑制作用。

3 討論

黃褐斑等皮膚色素沉著性疾病在臨床中較為常見，輕者影響美觀，重者甚至毀容，給患者身心帶來了巨大負(fù)擔(dān)。導(dǎo)致皮膚色素沉著的原因涉及黑素代謝的全過程，包含表皮中黑素細(xì)胞內(nèi)黑素的產(chǎn)生、黑素向周圍角質(zhì)形成細(xì)胞的轉(zhuǎn)運以及在角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)的降解［3］。研究［4］發(fā)現(xiàn)黑素細(xì)胞的過度增殖以及黑素合成的不斷增多是皮膚色素沉著性疾病發(fā)生發(fā)展的重要原因，這在CT結(jié)果中也得到證實。

UVB波長為280～320 nm，穿透深度達(dá)0.01～10 mm，是紫外線中造成皮膚損傷的主要元兇。UVB輻射引起皮膚色素沉著實際是一個生理性的防御過程，黑素小體從黑素細(xì)胞轉(zhuǎn)移到角質(zhì)形成細(xì)胞，減少紫外線誘導(dǎo)的DNA損傷。臨床上，高強(qiáng)度的紫外線和窄波UVB照射治療在白癜風(fēng)中的應(yīng)用目前也較為成熟。研究［5］表明皮膚在長時間UVB照射下會出現(xiàn)紅斑，繼之出現(xiàn)色素沉著，這在實驗中也得到了證實。在UVB照射所導(dǎo)致的色素沉著中，表皮角質(zhì)形成細(xì)胞膜部結(jié)合的干細(xì)胞因子表達(dá)上調(diào)，通過受體激活黑素細(xì)胞，從而導(dǎo)致色素沉著［6］。紫外線可促進(jìn)皮膚中α-黑素細(xì)胞刺激素的表達(dá)，引起色素沉著［7］。Hiramoto et al［8］研究發(fā)現(xiàn)，通過抑制小鼠α-黑素細(xì)胞刺激素的表達(dá)，從而抑制小鼠表皮的色素沉著。本研究電鏡結(jié)果顯示，UVB照射使黑素小體向角質(zhì)形成細(xì)胞的轉(zhuǎn)運明顯增多，并且促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的自噬活性，使黑素小體的降解增強(qiáng)，但黑素小體的轉(zhuǎn)運遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于其降解，故總體的效應(yīng)還是色素沉著加深。

雌激素作為一種甾體激素，不僅在皮膚損傷修復(fù)、毛發(fā)生長及皮膚老化等過程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用，同時也參與了皮膚的色素沉著過程。免疫組織化學(xué)研究［9］證實黃褐斑患者色素沉著部位皮膚中雌激素受體表達(dá)較正常皮膚增加。Kim et al［10］研究發(fā)現(xiàn)，雌激素通過上調(diào)PDZK1蛋白的表達(dá)，從而增加酪氨酸酶的表達(dá)，促進(jìn)黑素小體向角質(zhì)形成細(xì)胞轉(zhuǎn)運，促使黃褐斑的形成。此外，研究［11］發(fā)現(xiàn)乙烯雌酚能通過激活cAMP-PKA信號通路，上調(diào)黑素生成相關(guān)酶表達(dá)和增強(qiáng)酶活性，促進(jìn)黑素瘤細(xì)胞中黑素的生成。Hirobe et al［12］通過研究證實，雌激素對雌性黃色小鼠毛發(fā)中黑色素的含量起著決定性的作用。本研究顯示，一定濃度的雌二醇處理一定時間后能導(dǎo)致皮膚出現(xiàn)色素沉著，而結(jié)合UVB照射后，還可表現(xiàn)出協(xié)同的致色素沉著作用。在電鏡結(jié)果中，一定濃度的雌激素不僅能增強(qiáng)黑素小體的合成與轉(zhuǎn)運，同時可能抑制角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)的黑素小體降解過程，導(dǎo)致皮膚色素沉著加深，且難以消除，推測其可能在黃褐斑的發(fā)病中發(fā)揮作用。

此研究尚處于初步階段，結(jié)果表明色素沉著的發(fā)生發(fā)展與紫外線照射、體內(nèi)雌激素水平異常有著密切的關(guān)系。色素沉著不僅與黑素小體合成增加和轉(zhuǎn)運增強(qiáng)有關(guān)，也可能與黑素小體的降解受到抑制有關(guān)。

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The effect and mechanism of estradiol and UVB radiation on pigmentation of guinea-pig skin

Zhou Yingli，Song Xiuzu，Hong Weisong，et al
（Dept of Dermatology，Hangzhou Clinical College of Anhui Medical University，Third People′s Hospital of Hangzhou，Hangzhou 310009）

ObjectiveTo investigate the influence of estradiol and ultraviolet B（UVB）radiation on melanin metabolism of guinea-pig’s brown dorsal skin，and explore the relationship between the estrogen and ultraviolet in skin pigmentary disorder.MethodsHealthy suit guinea-pigs were selected in this study.The guinea-pigs skin was divided into solvent control group，UVB irradiation group，estradiol treatment group and UVB irradiation after estradiol pertreatment group（estradiol＋UVB group）.The concentrations of estradiol were set to 3.67×10－5，3.67× 10－4，3.67×10－3mol／L.The UVB exposure dose was unified as 500 mJ／cm2.In vivo confocal laser scanning microscopy（referred to as skin CT）and transmission electron microscopy were used to observe the effects of estradiol and UVB on melanin metabolism and degradation.Results①The pigmentation of guinea-pig skin was deepened after a certain concentration of estradiol treatment，increased gradually with the increasing of estradiol concentration（P＜0.05）.②The pigmentation of guinea-pig skin was also deepened significantly in UVB irradiation group，compared with non-UVB irradiation group（P＜0.05）.③The autophagy of epidermal keratinocytes of Guinea pigs increased with UVB irradiation，but decreased with estradiol treatment.ConclusionEstradiol and UVB irradiation can promote pigmentation of guinea-pig skin and the mechanism may be related to the promotion of melanosomes synthesis.The degradation of abnormal melanosomes may also be involved in the formation of pigmentation.

estradiol；pigmentation；melanosome；ultraviolet B

R 364.23

1000－1492（2015）01－0049－05

2014－09－11接收

國家自然科學(xué)基金（編號：81000697）；杭州市醫(yī)學(xué)重點專科專病項目（編號：20130733Q24）

安徽醫(yī)科大學(xué)杭州臨床學(xué)院（杭州市第三人民醫(yī)院）皮膚性病科，杭州 310009

周穎麗，女，碩士研究生；宋秀祖，男，副教授，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：songxiuzu＠yahoo.com