王 芳，金 銳，李 磊，程豐偉，羅 欣，張勝權

基礎醫(yī)學研究

TLR7激動劑Gardiquimod上調(diào)BxPC-3細胞中IL-15 mRNA表達

王 芳，金 銳，李 磊，程豐偉，羅 欣，張勝權

目的研究TLR7在胰腺癌BxPC-3細胞中表達，并探討TLR7激動劑激活TLR7后細胞因子白介素15（IL-15）的表達。方法通過Western blot和Real-time PCR分析TLR7在細胞內(nèi)的表達水平；BxPC-3細胞經(jīng)過不同時間點Gardiquimod（3 μg／ml）的處理后，Real-time PCR分析TLR7激活后IL-15 mRNA水平表達變化；Western blot分析Gardiquimod刺激細胞后，磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白質(zhì)絲氨酸蘇氨酸激酶（PI3K-AKT）信號通路的變化。結(jié)果Western blot和Real-time PCR結(jié)果顯示：與外周血單核細胞（PBMC）相比，TLR7在BxPC-3中弱表達；Real-time PCR分析顯示：Gardiquimod處理細胞后能刺激細胞中IL-15的表達；TLR7激動劑能夠激活PI3K-AKT信號通路。結(jié)論 Gardiquimod激活TLR7后能夠上調(diào)IL-15的表達，并且其激活與PI3KAKT信號途徑相關。

TLR7；Gardiquimod；IL-15；PI3K-AKT；BxPC-3

Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）是一類識別病原相關分子模式（pathogen associated molecular pattern，PAMP）的模式識別受體（pattern-recognition receptor，PRR）［1］。TLRs廣泛分布于體內(nèi)不同免疫細胞表面，如TLR1能在單核細胞、T、B淋巴細胞和NK細胞等多種細胞中表達，TLR3只能夠特異性表達于樹突狀細胞［2］。TLRs的生物學功能主要包括激活固有免疫和參與適應性免疫的應答的啟動［3］。同樣，TLR7在腫瘤的免疫治療中也發(fā)揮著十分重要的作用［4］。而磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白質(zhì)絲氨酸蘇氨酸激酶（phosphatidylinositol-3-kinase-protein serine threonine kinase，PI3K-AKT）信號通路與TLRs受體也有密切聯(lián)系，作為聯(lián)系細胞外信號分子與細胞內(nèi)的細胞因子之間的橋梁，在腫瘤細胞的生長、分化、凋亡等方面起著重要的調(diào)節(jié)作用［5］。Ha et al［6］研究顯示，TLR2配體可通過PI3K-AKT信號通路保護心臟進而緩解動脈缺血／再灌注損傷。同時，PI3KAKT在細胞功能調(diào)節(jié)如防御和免疫方面也發(fā)揮重要作用［7］。白介素-15（interleukin-15，IL-15）是一種細胞因子，源于T細胞，能夠在體內(nèi)T、B淋巴細胞、單核巨噬細胞等多種細胞中表達，其生物學功能廣泛，能誘導T細胞增殖、NK細胞分化等［8］。Shenoy et al［9］研究顯示IL-15能夠通過PI3K-AKT和JAK-STAT等信號通路誘導和抑制凋亡，從而對T細胞進行調(diào)節(jié)。在眾多腫瘤中，胰腺癌是一種高度惡性的腫瘤，與其高侵襲性、轉(zhuǎn)移性、耐藥性有關［10］。因此，腺癌的治療目前仍然是醫(yī)學界的難題。該研究旨在對TLR7與胰腺癌的關系以及TLR7配體Gardiquimod激活TLR7后對信號通路PI3K-AKT和下游細胞因子IL-15表達進行探討。

1 材料與方法

1.1 細胞與主要試劑胰腺癌BxPC-3細胞株購自中國科學院上海細胞庫，Gardiguimod購自美國Invitrogen公司，RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自美國Gibco公司，TLR7、βactin和PI3K-AKT抗體購自美國Cell signaling公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑和實時熒光定量PCR（Real-time PCR，RT-PCR）試劑均購自日本TaKaRa公司，引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2 引物登陸NCBI網(wǎng)站檢索人GAPDH、IL-15基因序列，Primer Premier 5.0軟件設計引物，見表1。

1.3 細胞培養(yǎng)從液氮復蘇胰腺癌BxPC-3細胞株，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)于含10%FBS的1640培養(yǎng)液。細胞長到70%～80%時，以4×104／ml的密度接種于24孔細胞培養(yǎng)板。實驗前1 d換無血清培養(yǎng)液，用Gardiquimod（3 μg／ml）在不同時間點（0.2、0.5、1.0、3.0、6.0、12.0、24.0 h）刺激BxPC-3細胞作為實驗組，以不做任何處理的細胞作空白對照組；并另設外周血單核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）對照，不做任何處理的細胞作陽性對照組。

1.4 RT-PCR檢測IL-15 mRNA的表達水平用TRIzol提取BxPC-3細胞中總RNA，以逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成方法合成cDNA。以cDNA為模板，加入特異性引物（表1）配成RT-PCR體系。具體如下：2× SYBR Premix Ex TaqⅡ10 μl、ROX DYEⅡ0.4 μl、上下游引物各0.4 μl、cDNA 2 μl、lddH2O 6.8 μl，總體積20 μl?？傮w系在AB 7500熒光定量分析儀上按程序運行，以GAPDH為內(nèi)參。最后用相對定量分析法分析BxPC-3組與PBMC組。

1.5 Western blot分析TLR7的表達及其激活的信號通路經(jīng)過不同時間點Gardiquimod刺激后，用細胞裂解液裂解細胞提取24孔板中的總蛋白。配制12%SDS-丙烯酰胺凝膠，將蛋白與5×loading buffer混合后上樣，濃縮膠中恒壓60 V，分離膠加至120 V，待電泳完成，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上（恒流150 mA，3 h）。用5%脫脂牛奶將膜封閉2 h后用TBST洗膜3次，每次10 min，一抗以工作濃度1∶500，4℃孵育過夜，加入辣根過氧化酶標記的二抗（TLR7為兔抗1∶10 000；β-actin為鼠抗1∶12 000；p-AKT為兔抗1∶14 000）。孵育2 h，用ECL發(fā)光劑壓膠片發(fā)光、顯影。

1.6 統(tǒng)計學處理采用SPSS 16.0軟件進行分析，數(shù)據(jù)用±s表示。組間計量資料采用成組設計的方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 TLR7在BxPC-3細胞中表達從BxPC-3及PBMC中提取mRNA和總蛋白，以PBMC作陽性對照組。Western blot和RT-PCR結(jié)果顯示：與陽性對照組相比，實驗組細胞中TLR-7表達，但較弱（F＝2 015）。見圖1。

2.2 Gardiquimod刺激BxPC-3細胞能夠上調(diào)IL-15的表達 IL-15表達具有波動性，IL-15-V1，3的表達呈現(xiàn)升高趨勢，在12.0 h時達峰值，約是空白對照組的4倍，之后下降；IL-15-V2也有上升趨勢，在3.0 h出現(xiàn)峰值，約是空白對照組的2.3倍。（FIL-15-V1，3＝1 836；FIL-15-V2＝4 580）。見圖2。

2.3 Gardiquimod激活BxPC-3細胞中PI3KAKT信號通路與空白對照組相比，加Gardiquimod刺激的細胞中p-AKT在0～3.0 h表達升高，并在3.0 h達到峰值，以后略微下降，呈明顯的劑量依賴性（F＝388.745）。見圖3。

3 討論

Gardiquimod是一種咪唑喹啉類小分子化合物，是咪喹莫特的衍生物，作為TLR7的配體，能夠激活胞內(nèi)區(qū)Toll／IL-1受體同源區(qū)（TIR），通過下游髓樣分化因子88（MyD88）信號通路，激活信號蛋白核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和PI3K等，從而誘導細胞因子IL-6、IL-15等因子，干擾素IFN-γ合成，從而調(diào)節(jié)免疫反應［11］。

實驗表明，TLR7能夠在胰腺癌細胞中表達，盡管很弱。進一步的研究［12］顯示TLR7的激活誘導下游細胞因子IL-15表達升高。IL-15組織分布極為廣泛，在骨骼肌和胎盤中IL-15 mRNA水平很高，也表達于淋巴細胞、單核細胞、NK細胞等表面［13］。IL-15與IL-2氨基酸序列不同，但空間結(jié)構相似，因此具有相似的生物學作用。主要有促進T細胞增殖，促進NK細胞胞毒活性產(chǎn)生CK，誘導B細胞增殖產(chǎn)生抗體，激活單核／巨噬細胞等等。故IL-15是參與體內(nèi)免疫應答的重要細胞因子［9］。本實驗中，TLR7激活后能夠上調(diào)IL-15的表達，進一步誘導體內(nèi)免疫系統(tǒng)，對胰腺癌的發(fā)展起到一定的抑制作用。

程豐偉等［14］研究顯示，PI3K-AKT信號通路為細胞內(nèi)信號傳導途徑，與腫瘤細胞的增殖與存活、侵襲與轉(zhuǎn)移等行為密切相關。PI3K的異常與類脂磷酸激酶（PTEN）的負調(diào)節(jié)失活有關，AKT異常會導致下游血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的高表達，而VEGF是血管生長、腫瘤增殖、遷移的關鍵。本研究結(jié)果顯示，PI3K-AKT信號通路被激活并在3.0 h出現(xiàn)了升高的峰值之后略微下降，說明TLR7的激活對胰腺癌的增殖、遷移等具有一定的抑制作用。

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The agonist of TLR7 Gardiquimod up-regulates the expression of interleukin-15 in BxPC-3 cells

Wang Fang，Jin Rui，Li Lei，et al
（Dept of Biochemistry and Molecular Biology，Anhui Medical University，Hefei 230032）

ObjectiveTo investigate the expression of Toll-like receptor 7（TLR7）in pancreatic cancer BxPC-3 cells，and to explore the effect of TLR7 activation on the expression of interleukin-15（IL-15）.MethodsBxPC-3 cells were used to analyze the expression of TLR7 by Western blot and Real-time PCR.The cells were treated with Gardiquimod（3 μg／ml）at different times，the expression of IL-15 at mRNA level by Real-time PCR.Western blot was performed to analyze the phosphorylation level changes of phosphatidyl inositol kinase serine／threonine kinase （PI3K-AKT）protein in BxPC-3 cells stimulated by TLR7 ligand Gardiquimod.ResultsWestern blot and Realtime PCR results showed that compared with peripheral blood mononuclear cells （PBMC），TLR7 presented weak expression in BxPC-3 cells.Gardiquimod could increase the expression of IL-15 in BxPC-3 cells.TLR7 agonist could activate the PI3K-AKT signaling pathway.ConclusionGardiquimod can up-regulate the expression of IL-15 and this effect can be associated with PI3K-AKT signaling pathway.

TLR7；Gardiquimod；interleukin-15 ；PI3K-AKT；BxPC-3

R 34

A

1000－1492（2015）01－0001－04

2014－09－24接收

國家自然科學基金（編號：81271748）

安徽醫(yī)科大學生物化學與分子生物學教研室，合肥230032

王 芳，女，碩士研究生；張勝權，男，博士，教授，碩士生導師，責任作者，E-mail：sqz36＠yahoo.com