宋　晶　郭家娟　李相軍崔英子　魏　巖　(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林　長(zhǎng)春　3002)

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不同濃度的糜酶對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠心肌肥厚細(xì)胞的構(gòu)建

宋晶郭家娟李相軍1崔英子魏巖(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林長(zhǎng)春130021)

〔摘要〕目的探討糜酶對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)心室肥厚模型的最佳誘導(dǎo)時(shí)間及濃度。方法將肥厚心肌細(xì)胞分為對(duì)照組(加無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液)和實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組分別給予糜酶(chymase)7. 5、15、30和60 μg/L 4個(gè)濃度組，分別培養(yǎng)24、48 h，誘導(dǎo)小鼠心肌細(xì)胞肥大，測(cè)定培養(yǎng)液中AngⅡ濃度、β-actin和ANP基因表達(dá)以評(píng)價(jià)模型是否成功。結(jié)果實(shí)驗(yàn)組中糜酶濃度為30 μg/L，培養(yǎng)48 h后培養(yǎng)液中AngⅡ濃度明顯高于對(duì)照組(P＜0. 05);并且糜酶濃度為30 μg/L，培養(yǎng)48 h后培養(yǎng)液中細(xì)胞β-actin和ANP基因表達(dá)高于對(duì)照組(P＜0. 05)。結(jié)論糜酶濃度在30 μg/L、培養(yǎng)48 h為誘導(dǎo)SHR心肌肥厚的最佳濃度及時(shí)間。

〔關(guān)鍵詞〕糜酶;自發(fā)性高血壓大鼠;心肌肥厚

1吉林大學(xué)藥學(xué)院

第一作者:宋晶(1987-)，女，在讀碩士，主要從事心血管疾病研究。

左心室肥厚是原發(fā)性高血壓(EH)導(dǎo)致靶器官損傷中最嚴(yán)重的類型，會(huì)引發(fā)惡性心律失常、心肌梗死、心衰等連鎖反應(yīng)。研究表明，抑制左心室肥厚會(huì)抑制這種連鎖反應(yīng)的發(fā)生，從而減少心血管事件的發(fā)病率和死亡率〔1〕。腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)在調(diào)節(jié)容量超負(fù)荷或壓力超負(fù)荷導(dǎo)致的心肌肥厚中起重要作用〔2〕;心肌細(xì)胞肌蛋白合成，導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大，從而發(fā)生心肌肥厚。血管緊張素(Ang)Ⅱ是目前最強(qiáng)的促心肌細(xì)胞肌蛋白合成因子〔3〕。而在心臟組織中，糜酶(Chymase)是AngⅡ形成的主要酶類之一，β-actin和ANP基因表達(dá)為心肌肥厚的重要標(biāo)志。檢測(cè)AngⅡ及相關(guān)信號(hào)分子基因、蛋白的表達(dá)，多層次、多角度系統(tǒng)研究糜酶AngⅡ途徑干預(yù)心室肥厚機(jī)制，可以進(jìn)一步豐富以心室肥厚為重要病理環(huán)節(jié)的心血管治療研究思路。

1　材料與方法

1. 1材料純化肥大細(xì)胞糜酶(Merck公司); AngⅡ放射免疫

分析試劑盒(上海偉寰生物科技有限公司);心肌細(xì)胞株H9c2(上海艾研生物科技有限公司);血清DMEM培養(yǎng)液(上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司)

1. 2方法將大鼠心肌細(xì)胞分為對(duì)照組(加無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液)和不同劑量糜酶刺激組，后者將糜酶加入到無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液中致糜酶終濃度為7. 5、15、30和60 μg/L，分別培養(yǎng)24 h和48 h后檢測(cè)各組培養(yǎng)上清AngⅡ含量及細(xì)胞β-actin和ANP基因表達(dá)。

1. 2. 1 AngⅡ濃度測(cè)定用AngⅡ放射免疫分析試劑盒測(cè)定。將細(xì)胞(105個(gè)/孔)接種于24孔板，培養(yǎng)48 h，每孔吸取800 μl培養(yǎng)液，加入裝有20 μl預(yù)冷的糜酶培養(yǎng)液(濃度分別為7. 5、15、30和60 μg/L)的管中，離心5 min(4℃，300 r/min)，取上清液，采用AngⅡ放射免疫分析試劑盒測(cè)定。

1. 2. 2采用逆轉(zhuǎn)錄Real-time PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞β-actin、ANP基因

1. 2. 2. 1 PCR反應(yīng)引物ANP基因:正向序列5＇-gga gcc tgc gaa ggt caa-3＇，反向序列5＇-tat ctt cgg tac cgg aag ctg t-3＇;β-actin:正向序列5＇-ccc gcg agt aca acc ttc t-3＇，反向序列5＇-cgt cat cca tgg cga act-3＇。

1. 2. 2. 2提取心肌細(xì)胞總RNA使用0. 25%胰蛋白酶-EDTA對(duì)心肌細(xì)胞進(jìn)行消化后，Hank液重懸細(xì)胞并轉(zhuǎn)至10 ml離心管中;懸浮培養(yǎng)細(xì)胞則直接轉(zhuǎn)到離心管中; 2 000 r/min離心10 min;加入Hank液，再離心、洗滌各兩次，去除上清液，冰浴(之后各項(xiàng)操作均在冰浴中進(jìn)行)。收獲細(xì)胞(5×106/L)，并將其移入到1. 5 ml Ep管內(nèi)。加入1 ml TRIzol試劑，混合均勻，放置于室溫中5 min;加入0. 2 ml氯仿，振搖時(shí)間為15 s，室溫下放置3 min; 4℃、10 000 r/min離心5 min，吸取上層水相轉(zhuǎn)移至新Ep管中，加入0. 5 ml的異丙醇，放置于室溫中10 min; 4℃條件下進(jìn)行低溫離心，10 000 r/min離心10 min，加入75%的1 ml乙醇，進(jìn)行搖振，再對(duì)其充分洗滌和沉淀，4℃、5 000 r/min離心5 min，棄上清液，真空干燥處理，沉淀重懸于100 μl的無(wú)RNase水中。保存于－70℃條件下備用;并用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度和純度。

1. 2. 2. 3 PCR擴(kuò)增依照PCR反應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟操作，將上游引物和下游引物各1 μl，Superscript/Tag混合物1 μl，待測(cè)RNA 1 μg，純水50 μl混合均勻，再加入30 μl石蠟。反應(yīng)條件: 55℃15 min，94℃12 min，1個(gè)循環(huán); 94℃15 s，55℃30 s，72℃1 min，35個(gè)循環(huán); 72℃10 min，1個(gè)循環(huán)。

1. 2. 2. 4 PCR產(chǎn)物電泳制取1. 5%瓊脂糖凝膠(含溴乙錠0. 3 mg/ml)，取PCR產(chǎn)物10 μl進(jìn)行電泳，電泳后將凝膠取出，將其放置于紫外分析儀內(nèi)進(jìn)行觀察并對(duì)其進(jìn)行定量分析，用待測(cè)基因/GAPDH比值代表待測(cè)ANP基因和β-actin mRNA的相對(duì)水平。

1. 3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS18. 0軟件行單因素方差分析、t檢驗(yàn)。

2　結(jié)果

糜酶濃度為30 μg/L，培養(yǎng)時(shí)間24 h、48 h時(shí)，AngⅡ濃度與對(duì)照組比較均有顯著差異(P＜0. 05)，同濃度糜酶培養(yǎng)48 h與培養(yǎng)24 h AngⅡ濃度比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0. 05);糜酶濃度為30 μg/L，培養(yǎng)時(shí)間24 h、48 h時(shí)，細(xì)胞中β-actin、ANP的含量與對(duì)照組比較均有顯著差異(P＜0. 05);相同濃度糜酶培養(yǎng)48 h與培養(yǎng)24 h，細(xì)胞中ANP含量比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0. 05)。見(jiàn)表1。

表1　測(cè)得培養(yǎng)液中AngⅡ、β-actin、ANP的濃度(x±s)

3　討論

RAS系統(tǒng)在調(diào)節(jié)前后負(fù)荷導(dǎo)致的心肌肥厚中起重要作用〔2〕，其中AngⅡ占主導(dǎo)地位。近年來(lái)研究證實(shí)，人類心肌局部AngⅡ主要來(lái)源于血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)和糜酶兩條途徑，在人體心臟80%的AngⅡ通過(guò)糜酶產(chǎn)生。多項(xiàng)研究證實(shí)，糜酶在心室肥厚、心肌纖維化及心衰的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用〔4〕。大量研究表明，β-actin作為Wnt/β-actin信號(hào)通路的關(guān)鍵成員在介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中調(diào)控細(xì)胞的增殖和凋亡〔5〕。ANP基因表達(dá)為心肌肥厚的重要標(biāo)志，在正常心肌組織中表達(dá)量很低，如果檢測(cè)到其表達(dá)量明顯增加，為病理性心肌肥大的可靠指標(biāo)。本研究同時(shí)以β-actin和ANP基因兩種指標(biāo)作為研究對(duì)象，使研究結(jié)果更加嚴(yán)謹(jǐn)可靠。而實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明不同濃度的糜酶刺激心肌細(xì)胞，使細(xì)胞內(nèi)AngⅡ濃度增高，細(xì)胞中肥大基因(β-actin、ANP)表達(dá)，導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大。而細(xì)胞內(nèi)AngⅡ濃度、β-actin與ANP的基因表達(dá)與糜酶濃度以及培養(yǎng)時(shí)間密切相關(guān)。通過(guò)測(cè)定實(shí)驗(yàn)指標(biāo)，糜酶濃度在30 μg/L、培養(yǎng)48 h時(shí)，為最佳誘導(dǎo)濃度及時(shí)間。

左心室肥厚為高血壓患者中最常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，嚴(yán)重影響人類的生活質(zhì)量，將血壓維持在正常水平，可有效減少并發(fā)癥;去除引起并發(fā)癥的誘因，可減少并發(fā)癥的發(fā)生，同時(shí)亦可通過(guò)此法，將血壓維持在正常水平。本實(shí)驗(yàn)為臨床上治療高血壓、減少高血壓引起的心肌肥厚提供了良好的理論依據(jù)。

4參考文獻(xiàn)

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〔2015-02-19修回〕

(編輯徐杰)

通訊作者:郭家娟(1978-)，女，博士，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事心血管疾病研究。

基金項(xiàng)目:教育部科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(211041)

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2015)20-5751-02;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2015. 20. 030

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔中圖分類號(hào)〕R544