王曉敏　席曉甜　劉海云　謝　斌　(江西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江西　南昌　330004)

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菟絲子總黃酮對(duì)血管平滑肌細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白的影響

王曉敏席曉甜劉海云謝斌(江西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江西南昌330004)

〔摘要〕目的觀察菟絲子總黃酮對(duì)血管平滑肌細(xì)胞凋亡的影響，并探討其保護(hù)作用機(jī)制。方法菟絲子經(jīng)溶劑提取，聚酰胺柱分離得黃酮提取物;大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞傳代培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)分四組，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡、Westen印跡法測(cè)定細(xì)胞Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)及RT-PCR測(cè)定C-myc基因表達(dá)情況。結(jié)果菟絲子總黃酮高劑量組能夠增加活細(xì)胞數(shù)量，降低死亡細(xì)胞數(shù)，特別是降低早期凋亡細(xì)胞數(shù)，與模型組比較有顯著差異(P＜0. 05);菟絲子總黃酮高劑量組能夠下降Bax蛋白表達(dá)量，與模型組比較有顯著差異(P＜0. 05)，而菟絲子總黃酮低劑量組升高Bcl-2蛋白表達(dá)量，與模型組比較有顯著差異(P＜0. 05);菟絲子總黃酮高劑量和低劑量組C-myc mRNA表達(dá)量顯著升高，與模型組比較有顯著性差異(P＜0. 05)，無(wú)劑量依從效應(yīng)。結(jié)論菟絲子總黃酮能抑制平滑肌細(xì)胞凋亡，其可能是通過(guò)能夠下降Bax蛋白和升高Bcl-2蛋白表達(dá)，改善抗凋亡和促凋亡的蛋白失衡，增加細(xì)胞周期C-myc的基因的表達(dá)來(lái)發(fā)揮對(duì)心血管起保護(hù)作用。

〔關(guān)鍵詞〕菟絲子總黃酮;凋亡; Bcl-2/Bax; C-myc;血管平滑肌細(xì)胞

血管平滑肌增殖是引起高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化和血管成型術(shù)再狹窄等心血管疾病的主要發(fā)病機(jī)制。平滑肌細(xì)胞的增殖與凋亡失調(diào)，造成了平滑肌細(xì)胞數(shù)量的過(guò)度增加，內(nèi)膜增厚、管腔變窄由此引起血管形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能改變，促發(fā)心血管疾病〔1〕。抑制血管平滑肌細(xì)胞異常增殖已成為當(dāng)今治療血管增殖性疾病的主要途徑，也成為近幾年的研究熱點(diǎn)〔2〕。本研究觀察溫補(bǔ)腎陽(yáng)的要藥有效部位——菟絲子總黃酮血管平滑肌細(xì)胞的保護(hù)作用，探討其對(duì)血管的保護(hù)作用機(jī)制。

1　材料和方法

1. 1藥物與儀器菟絲子經(jīng)本院中藥鑒定教研室鑒定為Cuscuta Chinensis Lam的成熟種子，經(jīng)溶劑提取，聚酰胺柱分離得總黃酮提取物，含量為85%〔3〕。DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco)，新生小牛血清(杭州四季青生物公司); Trizol試劑、AMV試劑(大連寶生生物工程有限公司); Bcl-2、Bax一抗(Santa Cruz公司); Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒(北京寶賽生物技術(shù)公司)。高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Sigma)，核酸蛋白分析儀(日本島津公司)，垂直電泳儀、轉(zhuǎn)移槽、梯度PCR儀(Bio-Red PTC 200)，凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Sigma)，流式細(xì)胞儀(美國(guó)Becton Dinson公司FACScan)。Imago-pro plus 6. 0圖像分析軟件(美國(guó)冷泉儀器公司)。

1. 2主要方法和步驟

1. 2. 1血管平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng)將SD大鼠胸主動(dòng)脈用Hanks液沖洗去除殘余血液，剝?nèi)ネ饽?，彎頭鑷子輕刮去內(nèi)膜后剪成1 mm×1 mm的小塊，均勻涂布瓶壁，加入20%FCS的DMEM的培養(yǎng)基后，放置37℃、5%CO2將培養(yǎng)孵箱中培養(yǎng)1～2 h，將瓶緩慢翻轉(zhuǎn)平放，靜置培養(yǎng)。待2 w后，80%組織塊爬出的細(xì)胞融合。在倒置顯微鏡下，呈現(xiàn)平滑肌細(xì)胞典型的“峰”、“谷”樣生長(zhǎng)和α-actin免疫組化法染色鑒定為血管平滑肌細(xì)胞〔4〕。

1. 2. 2實(shí)驗(yàn)分組取P4～P6代細(xì)胞分為正常組(正常血管平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)基);模型組(ox-LDL誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷條件培養(yǎng)基，過(guò)氧化氫終濃度200 mmol/L);菟絲子總黃酮高劑量組(10 mmol/L+過(guò)氧化氫終濃度200 mmol/L);菟絲子總黃酮低劑量組(5 mmol/L+過(guò)氧化氫終濃度200 mmol/L)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的第4代血管平滑肌細(xì)胞，以1×103個(gè)/孔細(xì)胞濃度接種于96孔培養(yǎng)板中，補(bǔ)液至100 μl，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合達(dá)50%時(shí)，換以含2% FBS DMEM培養(yǎng)液，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，按實(shí)驗(yàn)分組換液，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，換以含1 g/L MDMEM培養(yǎng)液，37℃孵育4 h，提取總RNA和蛋白。

1. 2. 3 RT-PCR測(cè)定C-myc mRNA表達(dá)Trizol一步法提總RNA，以蛋白核酸分析儀測(cè)定RNA濃度; M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶催化合成cDNA;用Primer5軟件設(shè)計(jì)引物(正義鏈: CCAAGCTCGTCTCAGAGAAG，反義鏈: AATTGTGCTGGTGCGTGGAC;β-actin:正義鏈: CCCATCTATGAGGGTTACGC，反義鏈: TTTAATGTCACGCACGATTTC); PCR擴(kuò)增目的基因，反應(yīng)條件: 94℃預(yù)變性5 min; 94℃30 s，55℃30 s，72℃1 min(35個(gè)循環(huán)); 72℃延伸10 min。取5 μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于1. 5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)灰度掃描。膠片進(jìn)行灰度掃描，以目的條帶的灰度值與β-actin條帶的灰度值的比值進(jìn)行分析。

1. 2. 4 Westen印跡法測(cè)定血管平滑肌細(xì)胞Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)根據(jù)蛋白提取液試劑盒說(shuō)明書，提取細(xì)胞總蛋白，取少量用BCA法測(cè)定蛋白濃度，加入5×SDS凝膠上樣緩沖液，沸水浴5 min，取等量蛋白，10%SDS-PAGE電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉的TBST封閉液封閉2 h，經(jīng)TBST充分漂洗(10 min×3)，加兔抗人多克隆抗體(稀釋度: Bcl-2蛋白1∶500; Bax蛋白1∶300;β-actin 1∶1 000)4℃孵育過(guò)夜，充分漂洗后加山羊抗兔二抗(稀釋度為1∶1 000)室溫孵育2 h，洗滌后ECL增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光顯色，β-actin作為內(nèi)參照，凝膠圖像分析儀分析結(jié)果。

1. 2. 5 Annexin V-FITC法檢測(cè)凋亡平滑肌細(xì)胞用磷酸緩沖液(PBS)液離心洗滌2次，將離心沉淀的細(xì)胞加入冰70%乙醇固定，保存4℃冰箱24 h，將固定的單細(xì)胞懸液調(diào)至為1×106/ml的濃度。取1 ml細(xì)胞，1 000 r/min，4℃離心10 min，棄上清。重復(fù)3次。將細(xì)胞重懸于200 μl上樣緩沖液。加入10 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，輕輕混勻，4℃反應(yīng)30 min。加入300 μl上樣緩沖液，在1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1. 3統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS16. 0軟件，進(jìn)行單因素方差分析，兩兩比較方差齊時(shí)LSD檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)用Dunnett T3檢驗(yàn)。

2　結(jié)果

2. 1菟絲子總黃酮對(duì)動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的凋亡影響菟絲子總黃酮高劑量組和低劑量組的死亡細(xì)胞數(shù)量比模型組明顯減少(P＜0. 05);高劑量組活細(xì)胞比模型組明顯增多(P＜0. 05)，低劑量組活細(xì)胞數(shù)量比模型組增多但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0. 05);高劑量組和低劑量組晚期凋亡細(xì)胞數(shù)量比模型組沒(méi)有明顯增多(P＞0. 05)，高劑量組其早期凋亡細(xì)胞數(shù)量顯著減少，與模型組比較均有顯著差異(P＜0. 05)。其他細(xì)胞與模型組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0. 05)，見表1。

表1　各組動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的凋亡變化(x±s，%，n=6)

2. 2菟絲子總黃酮對(duì)血管平滑肌細(xì)胞Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)影響模型組Bax蛋白表達(dá)升高和Bcl-2蛋白表達(dá)顯著下降，與正常組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0. 05)。菟絲子總黃酮高劑量組Bax蛋白表達(dá)量下降與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0. 05)，而Bcl-2蛋白表達(dá)升高，但無(wú)顯著差異(P＞0. 05);菟絲子總黃酮低劑量組Bax蛋白表達(dá)量下降但無(wú)顯著性差異(P＞0. 05)，而Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著性升高，與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0. 05);菟絲子總黃酮高、低劑量組之間無(wú)顯著差異，見表2和圖1。

表2　各組血管平滑肌細(xì)胞Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)變化(x ±s，n=6)

2. 3菟絲子總黃酮對(duì)血管平滑肌細(xì)胞C-myc mRNA表達(dá)模型組C-myc mRNA表達(dá)(1. 07±0. 06)顯著下降，與正常組(1. 16±0. 08)比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0. 05)，菟絲子總黃酮高劑量組C-myc mRNA表達(dá)量(1. 11±0. 04)顯著升高，與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0. 05)，菟絲子總黃酮低劑量組C-myc mR-NA表達(dá)量(1. 13±0. 05)顯著升高，與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0. 05)，但菟絲子總黃酮高、低劑量組無(wú)顯著差異(P＞0. 05)，無(wú)劑量依從效應(yīng)。

圖1　各組Bcl-2和Bax蛋白變化

3　討論

細(xì)胞凋亡是多種基因參與的復(fù)雜分子調(diào)控機(jī)制，Bcl-2原癌基因是目前最受關(guān)注的凋亡相關(guān)基因之一，通過(guò)編碼Bcl-2蛋白而發(fā)揮抗凋亡作用。Bcl-2蛋白可以通過(guò)抗氧化作用減少氧自由基的產(chǎn)生和脂質(zhì)過(guò)氧化物的形成。還可以通抑制細(xì)胞膜通道的形成，穩(wěn)定線粒體膜電位，而阻止細(xì)胞色素C從線粒體中的釋放，保護(hù)細(xì)胞膜穩(wěn)定細(xì)胞〔5〕。Bcl-2蛋白的BH3結(jié)構(gòu)域與促凋亡Bax，Bak基因形成異二聚體，從而維持促凋亡成員在細(xì)胞內(nèi)的定位分布，保護(hù)細(xì)胞不進(jìn)入凋亡程序〔6〕。

體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的凋亡。ox-LDL將平滑肌細(xì)胞阻滯在G2/M期從而誘導(dǎo)其凋亡，是通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞G蛋白偶聯(lián)受體，與Ras/Raf/MEK/MAPK通路有關(guān)〔7〕。本實(shí)驗(yàn)提示其能促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的凋亡，菟絲子總黃酮能改善抗凋亡和促凋亡蛋白失衡。

溫補(bǔ)腎陽(yáng)的中藥——菟絲子具有對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠心肌缺血有明顯的預(yù)防和治療作用，可減輕心肌缺血的程度和范圍，并且增加冠狀動(dòng)脈流量、擴(kuò)冠、降壓以及強(qiáng)心等作用〔8〕。本課題組前期研究表明，菟絲子總黃酮有促進(jìn)機(jī)體內(nèi)源性雌激素的產(chǎn)生，菟絲子總黃酮高、低劑量能明顯降低血脂中TG水平，能提高主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的雌激素受體陽(yáng)性表達(dá)，提示菟絲子總黃酮通過(guò)調(diào)整血脂代謝、增加內(nèi)源性雌激素水平及增加血管平滑肌雌激素受體發(fā)揮其對(duì)血管的保護(hù)作用〔9〕。

C-myc基因是細(xì)胞進(jìn)化過(guò)程中保守的癌基因家族myc基因家族的重要成員之一，3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子組成，編碼49 kD核內(nèi)磷酸化的蛋白質(zhì)，以調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。既是一種可使細(xì)胞無(wú)限增殖，促進(jìn)細(xì)胞分裂的基因，也是調(diào)控細(xì)胞凋亡基因，可以誘導(dǎo)除去生長(zhǎng)因子的平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞發(fā)生凋亡。用C-myc與Bcl-2共同轉(zhuǎn)染血管平滑肌細(xì)胞時(shí)，則誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞凋亡的活性被抑制〔10〕。本研究中菟絲子總黃酮可能通過(guò)升高C-myc基因表達(dá)，阻止血管平滑肌細(xì)胞凋亡。血管平滑肌凋亡效應(yīng)是多個(gè)通路相互協(xié)調(diào)，形成一個(gè)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)共同完成的。本實(shí)驗(yàn)菟絲子總黃酮僅對(duì)抑制血管平滑肌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制做初步的探討，對(duì)具體信號(hào)通路的影響尚有待進(jìn)一步研究。

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〔2014-06-17修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢(mèng)園)

通訊作者:謝斌(1975-)，男，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事中醫(yī)藥防治心血管疾病研究。

基金項(xiàng)目:江西省自然基金課題(2008GZY0018)

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2015)20-5742-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2015. 20. 026

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔中圖分類號(hào)〕R285

第一作者:王曉敏(1972-)，男，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事中醫(yī)藥防治心血管疾病研究。