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陽離子-氯離子聯合轉運蛋白抑制劑對氯胺酮麻醉模型小鼠的催醒影響及對其海馬凋亡的影響

唐俊霞馮念海陶琦(淄博市中心醫(yī)院麻醉科，山東淄博255036)

〔摘要〕目的探討陽離子-氯離子聯合轉運蛋白(CCC)抑制劑對氯胺酮麻醉模型小鼠的催醒影響及對其海馬凋亡的影響。方法選取幼年SPF級昆明種小鼠60只，隨機分為兩組，其中對照組30只，實驗組30只，予100 mg/kg氯胺酮腹腔注射，待小鼠翻正反射消失，反復腹腔注射100 mg/kg氯胺酮，維持麻醉時間為6 h后，予實驗組小鼠布美他尼溶液100 μg/kg腹腔注射，同時予對照組等量的生理鹽水腹腔注射。對比兩組小鼠的蘇醒時間、海馬區(qū)細胞凋亡密度以及海馬區(qū)NMDA-2B受體表達情況。結果實驗組小鼠的蘇醒時間明顯短于對照組(P＜0. 05);高倍鏡下觀察顯示體積較正常細胞小者為凋亡細胞，其細胞核內含紫藍色或黑色的凋亡小體，實驗組凋亡細胞明顯少于對照組;實驗組凋亡細胞密度與對照組比較明顯較低(P＜0. 05);免疫組化法檢測顯示NMDA-2B受體陽性細胞染色呈棕黃色，多位于CA3區(qū)海馬組織，分布均勻，與對照組比較，實驗組的陽性細胞數目明顯較少; Western印跡法測定結果顯示，實驗組小鼠的NMDA-2B受體灰度值明顯低于對照組(P＜0. 05)。結論CCC抑制劑對氯胺酮麻醉模型小鼠具有催醒作用，能夠明顯抑制其海馬細胞凋亡，對臨床具有指導意義，值得臨床推廣。

〔關鍵詞〕陽離子-氯離子聯合轉運蛋白抑制劑;氯胺酮麻醉;催醒;海馬凋亡

氯胺酮廣泛應用于小兒麻醉〔1〕。但有研究發(fā)現〔2〕，氯胺酮在麻醉過程中需要反復給藥，容易出現麻醉過深，蘇醒時間較長的現象，導致蘇醒延遲。另有研究顯示〔3〕，應用氯胺酮能夠使幼鼠的神經細胞凋亡，影響幼鼠成年后的學習、認知以及記憶能力。陽離子-氯離子聯合轉運蛋白(CCC)抑制劑能夠控制離子通道，影響細胞內外鈉離子、鉀離子、鈣離子、氯離子的轉運及N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體的表達〔4，5〕，能夠減少氯胺酮的負面作用，縮短蘇醒時間，防止神經細胞損傷。本文旨在探究CCC抑制劑對氯胺酮麻醉模型小鼠的催醒影響及對其海馬凋亡的影響。

1　對象與方法

1. 1實驗動物與分組選取幼年(出生7 d)的SPF級昆明種小鼠60只(由遼寧中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供)，雌性30只，雄性30只，體重(18±3)g。將大鼠隨機分為兩組，實驗組30只，對照組30只。將小鼠置入安靜、溫暖、濕度適中、光照充足的環(huán)境中，以標準飼料喂養(yǎng)，讓其自由進食水。

1. 2主要試劑和儀器鹽酸氯胺酮注射液(北京紫竹藥業(yè)有限公司);布美他尼注射液(遼寧玉皇藥業(yè)有限公司);小鼠NMDA-2B抗體試劑盒(上海豐壽實業(yè)有限公司);磷酸鹽緩沖液(PBS)(BOSTER公司); Western封閉液、專用一抗二抗稀釋液、羊抗兔二抗(南京生興生物科技有限公司);蛋白電泳儀、離心機(美國貝克曼庫爾特公司); DW-86W100超低溫冰箱(青島海爾); SpectraMax M5酶標儀(美國Molecular Devices)。

1. 3造模方法正常適應性飼養(yǎng)兩組小鼠3 d，全部小鼠予100 mg/kg氯胺酮腹腔注射，待小鼠連續(xù)仰臥3次且在5 s內不能站立時即表示翻正反射消失〔5〕，反復腹腔注射100 mg/kg氯胺酮，維持麻醉時間為6 h; 6 h后給予實驗組小鼠布美他尼溶液100 μg/kg腹腔注射，予對照組等量的生理鹽水腹腔注射。

1. 4觀察指標及檢測方法

1. 4. 1蘇醒時間小鼠翻正反射恢復即認為其蘇醒，也就是連續(xù)仰臥3次之后可以恢復直立〔6〕，記錄兩組小鼠自翻正反射消失6 h后至翻正反射恢復的時間。

1. 4. 2小鼠海馬區(qū)細胞凋亡情況檢測小鼠翻正反射恢復后，繼續(xù)常規(guī)飼養(yǎng)24 h。將小鼠麻醉后處死，斷頭，取海馬組織，置于液氮中保存。取出部分海馬組織，利用4%多聚甲醛固定，采用梯度酒精脫水，常規(guī)石蠟包埋，切成4 μm切片備用。

將切片脫蠟→室溫下，置于0. 1%TritonX100液中→10 min后，流水沖洗→PBS沖洗3次，1 min/次→37℃下，加入標記物→1 h后，PBS沖洗3次，1 min/次→37℃下，加入轉換液→30 min后，PBS沖洗3次，1 min/次→加入BCIP- NBT顯色→10 min后，流水沖洗→PBS沖洗3次，1 min/次→封片。

判定標準〔7〕:凋亡小體多位于細胞核內，染色呈紫藍或黑，顏色越深凋亡細胞的密度越大。在高倍顯微鏡下觀察凋亡細胞數，采用醫(yī)學圖像管理系統計算凋亡細胞密度值。

1. 4. 3免疫組化法〔8〕檢測小鼠海馬組織NMDA-2B受體表達水平將備用切片脫蠟，利用梯度濃度酒精水化;利用3%過氧化氫水溶液使過氧化物酶變性;切片置入高溫檸檬酸溶液，進行抗原修復;冷卻后用PBS洗滌;室溫下，加5%胎牛血清(BSA)封閉;去除血清，加入稀釋后NMDA-2B抗體，37℃孵育1 h; PBS清洗5次，滴加二抗工作液，37℃孵育; 30 min后，PBS清洗5次;加入二氨基聯苯胺(DAB)液顯色5 min; PBS清洗5次后，采用蘇木素復染;清洗后常規(guī)脫水、透明、封片，利用高倍顯微鏡觀察，染色呈棕黃色者為陽性細胞。

1. 4. 4 Western印跡法測定小鼠海馬組織NMDA-2B受體表達水平取出保存于液氮中的海馬組織，剪碎，利用勻漿器研磨光滑; 12 000 r/min離心20 min;取上清，加入上樣緩沖液;高溫加熱5 min，樣本加入上樣孔中;電泳槽電壓80 V，進行電泳;分離膠染色后，電壓改為120 V，電泳至染色區(qū)域距玻璃板1 cm;將凝膠染色轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上;室溫下，將PVDF膜置入含有Western印跡抗體的孵育盒中;封閉2 h后，用Tris鹽酸緩沖液(TBST)沖洗5 min，3次; PVDF膜置入稀釋的兔抗NMDA-2B溶液中，4℃搖床過夜;將PVDF膜置入稀釋后羊抗兔二抗溶液中2 h;清洗后，利用紅外激光成像系統掃描，觀察蛋白表達的灰度值〔7〕。

1. 5統計學方法應用SPSS19. 0軟件進行t檢驗、χ2檢驗。

2　結果

2. 1兩組小鼠蘇醒時間比較實驗組小鼠的蘇醒時間〔(3.17±2.36)min〕明顯短于對照組〔(6.35±2.74)min〕(P＜0.05)。

2. 2兩組小鼠海馬區(qū)細胞凋亡情況比較高倍鏡下觀察顯示體積較正常細胞小者為凋亡細胞，其細胞核內含紫藍色或黑色的凋亡小體，實驗組凋亡細胞明顯少于對照組;實驗組凋亡細胞密度(0. 98±0. 62)明顯低于對照組(3. 73±2. 11)(P＜0. 05)。見圖1。

2. 3免疫組化法檢測兩組小鼠海馬組織NMDA-2B受體表達比較NMDA-2B受體陽性細胞染色呈棕黃色，多位于CA3區(qū)海馬組織，分布均勻，與對照組比較，實驗組的陽性細胞數目明顯較少，見圖2。

2. 4 Western印跡法測定兩組小鼠海馬組織NMDA-2B受體表達比較實驗組小鼠的NMDA-2B受體灰度值(0. 81±0. 02)明顯低于對照組(1. 13±0. 04)(P＜0. 05)。見表1。

圖1　兩組小鼠海馬組織細胞凋亡情況(×400)

圖2　兩組NMDA-2B受體表達情況(×400)

表1　 Western印跡法測定小鼠海馬組織NMDA-2B受體蛋白比較(x±s)

3　討論

氯胺酮是一種NMDA受體拮抗劑，具有起效快、鎮(zhèn)痛效果好、對呼吸系統影響小等特點〔9〕，廣泛應用于小兒麻醉。雖然氯胺酮安全性較高，但近年來有研究發(fā)現，由于麻醉作用表淺，需反復用藥，容易導致患者蘇醒的延遲〔10〕。另有研究認為，小兒腦神經尚未發(fā)育完全，生長過程中極易受到干擾〔11〕，氯胺酮對神經功能的抑制作用亦能影響神經細胞生長發(fā)育，而且，有實驗研究表明，氯胺酮能夠誘導幼鼠神經細胞的凋亡〔12〕，影響記憶、學習等功能。

本研究結果提示CCC抑制劑可以明顯抑制小鼠海馬組織細胞凋亡，防止神經損傷;另外CCC抑制劑可能通過減少NMDA-2B受體的表達，來抑制神經細胞凋亡。資料顯示，CCC抑制劑可以影響細胞膜氯鈣通道的開放，促進鈣離子內流，增加細胞內鈣離子濃度〔13〕，激活絲裂素活化蛋白激酶，消除氯胺酮對NMDA的拮抗作用〔14〕，減少細胞凋亡。本研究提示CCC抑制劑對氯胺酮麻醉小鼠具有催醒作用，可防止蘇醒延遲。

4參考文獻

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〔2015-02-11修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

〔文章編號〕1005-9202(2015)20-5740-02;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2015. 20. 025

〔文獻標識碼〕A

〔中圖分類號〕R614

第一作者:唐俊霞(1968-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事老年麻醉研究。