荊鑫鑫　劉鴻飛　張　濤　張　強(qiáng)　葛堂棟　王明富　王躍新(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江　佳木斯　154007)

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PTD4-Apoptin融合蛋白可溶性表達(dá)及其對(duì)Hela細(xì)胞的抑制作用

荊鑫鑫劉鴻飛張濤張強(qiáng)葛堂棟王明富王躍新(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江佳木斯154007)

〔摘要〕目的構(gòu)建PTD4-Apoptin融合蛋白的原核表達(dá)載體并表達(dá)蛋白，檢測(cè)其對(duì)Hela細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。方法人工合成Apoptin序列和PTD4序列，構(gòu)建pGEX-6p-1-PTD4-Apoptin原核表達(dá)載體，使其在E. coli BL21(DE3)中表達(dá)。使用GST親和層析柱純化融合蛋白，并使用超濾管濃縮純化后的目的蛋白，得到高濃度的融合蛋白。向Hela細(xì)胞中加入融合蛋白，檢測(cè)其對(duì)Hela細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。結(jié)果PTD4-Apoptin融合蛋白在大腸桿菌中可溶性表達(dá)成功，對(duì)Hela細(xì)胞生長(zhǎng)具有抑制作用，PTD4-Apoptin對(duì)Hela細(xì)胞抑制率達(dá)82. 34%。結(jié)論成功構(gòu)建PTD4-Apoptin融合蛋白表達(dá)載體，并表達(dá)可溶性的融合蛋白，PTD4-Apoptin對(duì)Hela細(xì)胞具有明顯的抑制作用。

〔關(guān)鍵詞〕Apoptin; PTD4; Hela

凋亡素(Apoptin)是雞貧血病毒(CAV)編碼的對(duì)正常細(xì)胞無(wú)毒性作用的小分子蛋白質(zhì)〔1，2〕，可選擇性地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，而不傷害正常細(xì)胞，因此Apoptin是一種潛在的抗腫瘤藥物。天然Apoptin很難透過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞〔3〕，如果在Apoptin一級(jí)序列前連接上可介導(dǎo)生物大分子物質(zhì)透過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的穿膜肽，即可穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞〔4〕。TAT穿膜肽與Apoptin連接表達(dá)的融合蛋白具有良好的抑瘤作用〔5〕，但人工合成的穿膜肽PTD4較TAT結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定且穿膜效率更高〔6〕。目前有構(gòu)建PTD4-Apoptin表達(dá)載體并表達(dá)，但得到的是PTD4-Apoptin融合蛋白的包涵體，還需要復(fù)性才具有活性〔7，8〕。本實(shí)驗(yàn)旨在構(gòu)建PTD4-Apoptin融合蛋白的可溶性表達(dá)載體并表達(dá)，獲得對(duì)腫瘤細(xì)胞具有高效穿膜作用的可溶性PTD4-Apoptin融合蛋白，研究其對(duì)Hela細(xì)胞的抑制作用。

1　材料和方法

1. 1載體和細(xì)胞質(zhì)粒pGEX-6p-1購(gòu)于深圳偉通生物科技有限公司，E. coli BL21(DE3)感受態(tài)菌購(gòu)于天根生物科技有限公司，E. coli DH 5α、人宮頸癌Hela細(xì)胞由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)惠贈(zèng)。

1. 2試劑質(zhì)粒提取試劑盒、DNA marker購(gòu)于天根生物科技有限公司，SDS-PAGE凝膠試劑盒、蛋白質(zhì)marker、4×SDS上樣緩沖液、離心超濾濃縮管、MTT試劑盒購(gòu)于北京索萊寶生物科技有限公司，GST SefinoseTM Resin購(gòu)于上海生工科技有限公司，限制性內(nèi)切酶BamH I、EcoR I、Xho I、T4 DNA連接酶購(gòu)于大連寶生物科技有限公司。

1. 3表達(dá)載體的構(gòu)建

1. 3. 1 pGEX-6p-1-Apoptin載體構(gòu)建優(yōu)化Apoptin的編碼序列，使其在大腸桿菌中能更好表達(dá)。優(yōu)化后的Apoptin編碼基因序列由上海生工生物工程有限公司合成，連接入質(zhì)粒載體pGEX-6p-1的EcoR I和Xho I位點(diǎn)之間，得到重組載體pGEX-6p-1-Apoptin。

1. 3. 2 PTD4序列合成根據(jù)PTD4氨基酸序列YARAAARQARA，合成PTD4的DNA序列的2條互補(bǔ)的單核苷酸鏈，編碼鏈5＇端加上BamH I限制性酶切位點(diǎn)的黏性末端，反義鏈的5＇端加上EcoR I限制性酶切位點(diǎn)的黏性末端，由上海生工生物工程有限公司合成。正向序列: 5＇-GATCCTACGCCCGTGCCGCAGCCCGTCAGGCCCGTGCCG-3＇;反向序列: 5＇-AATTCGGCACGGGCCTGACGGGCTGCGGCACGGGCGTAG-3＇;將2條單核苷酸鏈等摩爾混合，加熱至95℃，降溫至25℃，形成雙鏈DNA分子。

1. 3. 3重組表達(dá)載體pGEX-6p-1-PTD4-Apoptin的構(gòu)建限制性內(nèi)切酶BamH I和EcoR I雙酶切重組質(zhì)粒載體pGEX-6p-1-Apoptin，使用T4 DNA連接酶將PTD4的雙鏈DNA分子與重組質(zhì)粒載體pGEX-6p-1-Apoptin酶切片段16℃連接過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E. coli DH 5α感受態(tài)菌株中，使用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，酶切驗(yàn)證，將驗(yàn)證正確的質(zhì)粒送往上海生工生物工程有限公司，進(jìn)行基因測(cè)序。

1. 3. 4表達(dá)載體pGEX-6p-1-PTD4-GFP的構(gòu)建構(gòu)建成功的表達(dá)載體pGEX-6p-1-PTD4-Apoptin由武漢淼靈生物科技有限公司改造為pGEX-6p-1-PTD4-GFP表達(dá)載體。

1. 4融合蛋白的表達(dá)重組載體pGEX-6p-1-PTD4-GFP和pGEX-6p-1-PTD4-Apoptin轉(zhuǎn)化至E. coli BL21(DE3)菌株。含目的質(zhì)粒的菌株加入含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)至OD600為0. 4～0. 6，加入IPTG至終濃度為0. 01 mmol/L，25℃誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h，4℃存放過(guò)夜，同等條件下以pGEX-6p-1空載體為對(duì)照。離心收集菌體，冰預(yù)冷的PBS緩沖液重懸菌體，超聲破碎，離心收集上清和沉淀，進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)。

1. 5融合蛋白的純化10倍柱體積冰預(yù)冷的PBS平衡GST親和層柱待用;收集破菌液上清，0. 22 μm濾膜過(guò)濾后上柱; 5倍柱體積的PBS洗柱4次;加入2 ml GST洗脫緩沖液洗脫目的蛋白，多次洗脫后，收集洗脫液，使用4 ml的超濾柱濃縮，并更換蛋白緩沖液。

1. 6 PTD4-Apoptin融合蛋白對(duì)Hela細(xì)胞的抑制作用收集Hela細(xì)胞，分于96孔板，3 000個(gè)/孔。置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，加入PTD4-GFP和PTD4-Apoptin融合蛋白，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后吸去上清，用PBS洗滌后，加入MTT工作液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，然后吸去上清，加入Formanzan溶解液，置于搖床上振蕩，待結(jié)晶紫充分溶解后，在490 nm波長(zhǎng)下測(cè)量各孔的吸光值。以pGEX-6p-1空質(zhì)粒載體的提取物作為對(duì)照。

1. 7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SAS9. 1. 3軟件進(jìn)行單因素方差分析及t檢驗(yàn)。

2　結(jié)果

2. 1表達(dá)載體的鑒定表達(dá)載體pGEX-6p-1-PTD4-GFP使用EcoR I和Xho I酶切驗(yàn)證;表達(dá)載體pGEX-6p-1-PTD4-Apoptin，使用BamH I和Xho I酶切驗(yàn)證，以pGEX-6p-1-Apoptin和pGEX-6p-1空質(zhì)粒載體作為對(duì)照。pGEX-6p-1-PTD4-GFP雙酶切后在700 bp出現(xiàn)條帶，與預(yù)期結(jié)果一致，見(jiàn)圖1A。pGEX-6p-1-PTD4-Apoptin載體和pGEX-6p-1-Apoptin雙酶切后，在400 bp左右出現(xiàn)條帶，而且pGEX-6p-1-PTD4-Apoptin的酶切片段略大于pGEX-6p-1-Apoptin的酶切片段，與預(yù)期結(jié)果一致，見(jiàn)圖1B。基因測(cè)序結(jié)果顯示目的基因片段序列正確，見(jiàn)圖2。

圖2　 PTD4-Apoptin測(cè)序圖譜

2. 2融合蛋白的表達(dá)和純化載體表達(dá)提取液進(jìn)行SDSPAGE電泳，以空質(zhì)粒載體作為對(duì)照。電泳結(jié)果顯示，pGEX-6p-1-PTD4-GFP表達(dá)提取液上清和沉淀都在分子量43～70 kD之間有條帶，與預(yù)期融合蛋白的分子量計(jì)算值54 kD基本相符，而且在上清中融合蛋白大量表達(dá)。pGEX-6p-1-PTD4-Apoptin表達(dá)提取液上清和沉淀都在分子量31～43 kD之間有條帶，與預(yù)期融合蛋白的分子量計(jì)算值40 kD基本相符，而且融合蛋白在上清中的表達(dá)量明顯高于沉淀，說(shuō)明pGEX-6p-1-PTD4-Apoptin主要表達(dá)可溶性的PTD4-Apoptin融合蛋白，見(jiàn)圖3～5。

圖3　 PTD4-GFP融合蛋白表達(dá)

圖4　 PTD4-Apoptin融合蛋白表達(dá)

目的蛋白經(jīng)純化后SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，pGEX-6p-1-PTD4-GFP載體在分子量43～70 kD之間出現(xiàn)單一條帶，見(jiàn)圖6，表明PTD4-GFP融合蛋白純化成功。pGEX-6p-1-PTD4-Apoptin載體在分子量31～43 kD之間出現(xiàn)單一條帶，見(jiàn)圖7，表明PTD4-Apoptin融合蛋白純化成功。

圖5　 PTD4-GFP融合蛋白純化

圖6　鑒定PTD4-Apoptin融合蛋白

圖7　 PTD4-Apoptin融合蛋白對(duì)Hela細(xì)胞的抑制作用

2. 3 PTD4-Apoptin融合蛋白對(duì)宮頸癌細(xì)胞的抑制作用圖7可見(jiàn)，MTT結(jié)果顯示，PTD4-Apoptin融合蛋白與Hela細(xì)胞孵育后，對(duì)Hela細(xì)胞的抑制率達(dá)82. 34%，PTD4-Apoptin融合蛋白對(duì)Hela細(xì)胞具有明顯的抑制作用(P＜0. 001)，并且隨著PTD4-Apoptin融合蛋白濃度的升高，其對(duì)Hela細(xì)胞抑制作用也增強(qiáng);而以PTD4-GFP和pGEX-6p-1提取物的對(duì)照組對(duì)Hela細(xì)胞并無(wú)明顯抑制作用(P＞0. 05)。

3　討論

為了解決天然Apoptin難以透過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞的特性，本研究利用基因工程的方法構(gòu)建PTD4-Apoptin融合蛋白，利用穿膜肽的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)活性使凋亡素進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。根據(jù)密碼子偏好性原則優(yōu)化了PTD4和Apoptin的編碼序列，使其能在大腸桿菌中更容易表達(dá)，構(gòu)建pGEX-6p-1-PTD4-Apoptin表達(dá)載體，可表達(dá)出結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定的PTD4-Apoptin可溶性蛋白，且表達(dá)的PTD4-Apoptin融合蛋白具有顯著抑制Hela細(xì)胞生長(zhǎng)的作用; 因PTD4-GFP融合蛋白對(duì)Hela細(xì)胞并無(wú)抑制作用，故PTD4-Apoptin融合蛋白抑制Hela細(xì)胞生長(zhǎng)的作用是Apoptin的功效。本研究構(gòu)建的pGEX-6p-1-PTD4-Apoptin表達(dá)載體，成功避開(kāi)了因表達(dá)包涵體需要復(fù)性的過(guò)程，可直接得到表達(dá)大量活性PTD4-Apoptin融合蛋白，簡(jiǎn)化了PTD4-Apoptin融合提取分離純化步驟，為進(jìn)一步研究Apoptin的抗腫瘤作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。由于pGEX-6p-1-PTD4-Apoptin表達(dá)的PTD4-Apoptin融合蛋白的前端含有谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)標(biāo)簽，該標(biāo)簽對(duì)蛋白活性是否產(chǎn)生一定的影響尚需進(jìn)一步研究。

4參考文獻(xiàn)

1 Zhou S，Zhang M，Zhang J，et al．Mechanisms of apoptin-induced cell death〔J〕．Med Oncol，2012; 29(4): 2985-91.

2武曉燕，候玲玲，晏瓊，等.凋亡素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制及其在腫瘤治療中的應(yīng)用〔J〕．生物學(xué)進(jìn)展，2014; 45(1): 45-8.

3 Heilman DW，Teodoro JG，Green MR. Apoptin nucleocytoplasmic shuttling is required for cell type-specific localization，Apoptosis，and recruitment of the anaphase-promoting complex/cyclosome to PML bodies〔J〕．J Virol，2006; 80(15): 7535-45.

4劉德純，袁鵬飛，陳彥彬，等. TAT-Apoptin融合蛋白用于抗肝癌實(shí)驗(yàn)研究〔J〕．中外醫(yī)療，2014; 15(1): 70-2.

5劉雪梅，崔劍，候劍偉，等. TAT-Apoptin融合蛋白分泌表達(dá)載體的構(gòu)建及其活性檢測(cè)〔J〕．中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013; 42(1): 45-8.

6李峰，陳嵐，肖新莉，等.蛋白質(zhì)-外源物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的新工具〔J〕．生命的化學(xué)，2004; 24(3): 192-5.

7 Sun J，Yan Y，Wang XT，et al．PTD4-apoptin therapy inhibits tumor growth in vivo〔J〕．Int J Cancer，2009; 124: 2973-81.

8 Jin JL，Gong J，Yin TJ，et al．PTD4-Apoptin protein and dacarbazine show synergistic antitumor effect on B16-F1 melanoma in vitro and in vivo〔J〕．Eur J Pharmacol，2011; 654(1): 17-25．

〔2014-09-19修回〕

(編輯李相軍)

通訊作者:張濤(1964-)，女，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事抗腫瘤藥物研究。

基金項(xiàng)目:黑龍江省自然基金項(xiàng)目(No. H201360);佳木斯大學(xué)研究生創(chuàng)新項(xiàng)目(No. LZR2014 _ 005);黑龍江省教育廳項(xiàng)目(No. 12531663);佳木斯大學(xué)重大項(xiàng)目(No. Szp2012-01)

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2015)20-5737-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2015. 20. 024

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔中圖分類號(hào)〕R73

第一作者:荊鑫鑫(1988-)，女，在讀碩士，主要從事抗腫瘤藥物研究。