任亞君　熊枝繁　曹仕瓊　熊莉娜　涂　艷張　芹熊　亮程漢英(華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院消化內(nèi)科，湖北　武漢　40077)

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熱休克蛋白90、缺氧誘導(dǎo)因子-1α在大腸癌中的表達及意義

任亞君熊枝繁曹仕瓊熊莉娜涂艷1張芹2熊亮3程漢英
(華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院消化內(nèi)科，湖北武漢430077)

〔摘要〕目的觀察熱休克蛋白90(HSP90)、缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α在大腸癌發(fā)生發(fā)展過程中的表達及意義。方法運用免疫組織化學(xué)法檢測HSP90，HIF-1α兩者在大腸癌及正常組織中的表達情況。結(jié)果HSP90、HIF-1α在正常大腸組織，大腸腺癌中的陽性率分別為: 30%、63. 0%; 15. 0%、71. 7%。兩者在正常組織和大腸腺癌中的表達差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P = 0. 013，P＜0. 001)。HSP90蛋白的表達與大腸癌組織的分化程度，Duke分期及是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P＜0. 05)，HIF-1α的表達與Duke分期及是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P＜0. 05);通過相關(guān)性分析，兩者具有明顯相關(guān)性(P＜0. 01)。結(jié)論HSP90，HIF-1α可能與大腸腺癌的發(fā)生、浸潤及轉(zhuǎn)移有關(guān);兩者的協(xié)同作用可能參與了大腸癌的發(fā)生發(fā)展。

〔關(guān)鍵詞〕大腸癌;熱休克蛋白(HSP)90;缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α;免疫組織化學(xué)

1華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院老年病科

2華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院病理科

3華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院檢驗科

第一作者:任亞君(1987-)，女，在讀博士，主要從事細胞因子與消化道腫瘤的關(guān)系研究。

大腸癌近年來發(fā)病率有增高的趨勢〔1〕。熱休克蛋白(HSP)90，對血管形成，腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移，腫瘤細胞增殖，細胞周期進程及凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中多種致癌蛋白的構(gòu)象、穩(wěn)定性及功能的維持均很重要〔2〕。缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α，對腫瘤的血管再生，糖酵解代謝及腫瘤的侵襲性均有調(diào)節(jié)作用〔3～5〕。本研究通過免疫組織化學(xué)SABC法檢測大腸癌組織中HSP90及HIF-1α的表達，觀察兩者與大腸癌臨床病理特征的關(guān)系，探討兩者在大腸癌發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移過程中的作用。

1　資料與方法

1. 1一般資料選取華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和、梨園醫(yī)院2004年1月至2012年10月病理科存檔石蠟包埋組織及2012年10月至2013年1月期間手術(shù)切除的新鮮大腸癌組織，所有病例術(shù)前均未行放化療，術(shù)后均經(jīng)病理證實。大腸腺癌46例，男28例，女18例;年齡36～81(中位60. 5)歲，結(jié)腸癌25例，直腸癌21例;高中分化29例，低分化17例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移16例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30例;例; Duke分期A+B期30例，C+D 期16例;同時取距離腫瘤10 cm以上正常組織20例作對照。

1. 2主要試劑鼠抗人HSP90單克隆抗體(1∶100稀釋)，鼠抗人HIF-1α單克隆抗體(1∶100稀釋)，均購自Abcam公司，二抗購自Vector公司，三抗購自Sigma公司。

1. 3方法所有標(biāo)本均由4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水，透明，石蠟包埋，4 μm連續(xù)石蠟切片，烤片，脫蠟，入水，破膜，pH6. 0檸檬酸液中微波熱修復(fù)中火5 min，停3 min，中火5 min; PBS清洗，加3%H2O2室溫下避光反應(yīng)30 min; PBS清洗，加1∶2 000稀釋的酶k，于37℃溫箱反應(yīng)20 min，; PBS清洗，加2%BSA于37℃溫箱反應(yīng)30 min;甩液，加一抗，4℃孵育36 h，后室溫復(fù)溫2 h; PBS清洗，加二抗，37℃溫箱孵育1 h; PBS清洗，加SABC 液37℃孵育1 h; PBS清洗，DAB顯色8～10 min，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片，其中以PBS代替一抗為陰性對照，用已知HSP90及HIF-1α陽性的大腸癌組織切片作陽性對照。

1. 4結(jié)果判定每例切片隨機抽取5個高倍鏡視野，腫瘤細胞陽性率分值為:＜10%，0分; 10%～25%，1分; 26%～50%，2 分; 51%～75%，3分;＞75%，4分;染色強度評分為:無色，0分;淡黃色，1分;棕黃色，2分;褐色，3分。兩者得分相乘，陰性≤2 分;陽性≥3分。

1. 5統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS12. 0軟件進行χ2檢驗和Spearman等級相關(guān)分析。

2　結(jié)果

2. 1 HSP90與HIF-1α蛋白在大腸癌及正常組織中的表達HSP90主要表達在腫瘤細胞的胞質(zhì)和胞核，為棕黃色顆粒(圖1)，HSP90在正常組織，大腸腺癌中表達的陽性率分別為: 30. 0%，63. 0%，二者差異顯著(P＜0. 05); HIF-1α主要表達在腫瘤細胞的胞質(zhì)和(或)胞核，為棕黃色顆粒(圖1)。HIF-1α在正常組織、大腸腺癌中表達的陽性率分別為: 15. 0%，71. 7%，二者差異顯著(P＜0. 05，表2)。

2. 2 HSP90與HIF-1α蛋白在大腸癌中表達及其與大腸癌臨床病理特征的關(guān)系HSP90表達與性別、年齡、部位無關(guān)(P＞0. 05);與分化程度、Duke分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P＜0. 05)。HIF-1α表達與性別、年齡、部位、分化程度無關(guān)(P＞0. 05);與Duke分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P＜0. 05)(表1)。

2. 3 HSP90與HIF-1α蛋白在大腸癌組織中表達的相關(guān)性HSP90與HIF-1α在大腸癌組織中表達的相關(guān)系數(shù)(r= 0. 420，P＜0. 01)，表明兩者呈正相關(guān)。

表1　 HSP90與HIF-1α在大腸癌中的陽性表達與大腸癌臨床病理特征的相關(guān)性〔n(%)〕

圖1　 HSP90、HIF-1α在大腸癌組織中的表達(SABC法，×400)

3　討論

腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移侵襲是多基因，多因素，多階段共同作用的結(jié)果。HSPs又稱分子伴侶，其氨基酸序列高度保守，是細胞內(nèi)蛋白質(zhì)平衡的主要調(diào)控者，指導(dǎo)胞質(zhì)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，線粒體內(nèi)蛋白質(zhì)的折疊，轉(zhuǎn)運和細胞內(nèi)定位，修復(fù)及降解變性蛋白，對錯誤折疊的蛋白質(zhì)進行再折疊，防止蛋白質(zhì)組錯配與集聚，并參與真核細胞內(nèi)多種調(diào)控蛋白的最后激活，參與多種大分子蛋白復(fù)合體的重構(gòu)，包括參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，轉(zhuǎn)錄，細胞分裂，遷移及分化的蛋白質(zhì)。在高溫，重金屬，缺氧及酸中毒等應(yīng)激原存在的時候，其含量會增加〔6，7〕。

按分子量大小，HSPs可分為HSP110，90，70等〔8〕，HSP90即為分子量約90 kD的大分子蛋白質(zhì)，主要由HSP90a，HSP90β組成，亦包含存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白94(GRP94)及存在于線粒體中的TNF受體調(diào)控蛋白(TRAP1)〔9〕。生理狀態(tài)下，HSP90占細胞內(nèi)總蛋白量的1%～2%，在應(yīng)激狀態(tài)下，含量增長約2～10倍〔6，7，10〕。有研究表明在多種實體瘤(乳腺癌〔6〕，肝細胞性肝癌〔11〕，胃癌，鼻咽癌及卵巢癌〔12，13〕等)及血液學(xué)惡性腫瘤中表達均增加〔6〕。

HSP90的目的蛋白包括參與腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)2和尿激酶，維持血管再生的HIF、上皮生長因子受體(rEGFR)、類固醇受體輔助活化因子(SRC)等〔7，9〕，并通過調(diào)節(jié)蛋白激酶B(AKT)，腫瘤壞死因子受體(TNFR)，核因子κB的功能而抑制腫瘤細胞的凋亡。有研究示，結(jié)腸癌中HSP復(fù)合物表達水平與增殖細胞核抗原(PCNA)相關(guān)，認為HSP復(fù)合物可能與腫瘤細胞的快速增殖有關(guān)〔7，14〕。本研究表明在大腸癌組織中HSP90蛋白的表達明顯高于正常組織，提示可能在大腸癌形成初，因體內(nèi)已存在缺氧，酸中毒等應(yīng)激源，從而使大腸癌組織中HSP90的表達量明顯高于正常組織。

缺氧及遺傳變異可通過多種途徑使HIF-1α含量增加〔4，15～17〕。在多種腫瘤如結(jié)腸癌，乳腺癌，胃癌，肺癌，皮膚癌，卵巢癌，胰腺癌，前列腺癌和腎癌中均發(fā)現(xiàn)HIF-1α的高表達〔18〕。

HIF-1α作為轉(zhuǎn)錄激活因子，既參與13種不同的葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白、糖酵解酶、VEGF基因的編碼，又參與紅細胞生成素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、內(nèi)皮素-1、誘導(dǎo)型合成酶、血紅素氧化酶1、IGF-2、IGF結(jié)合蛋白2、3基因的編碼，而這些蛋白質(zhì)多數(shù)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)〔3，18〕。有研究表明由于在結(jié)腸腺瘤及前列腺上皮內(nèi)瘤變等良性病變中亦發(fā)現(xiàn)HIF-1α呈高表達〔18〕，提示HIF-1α的增多可能通過使利于腫瘤發(fā)生發(fā)展的多種基因高表達，從而為大腸癌的發(fā)生提供了有利的環(huán)境。另外，HIF-1亦可調(diào)控編碼組織蛋白酶D，MMP2，尿激酶纖溶酶原激活物受體(uPAR)，纖連蛋白1，波形蛋白TGFα，自分泌移動因子，角蛋白14，18，19等已被確定在細胞侵襲的病理生理中起重要作用的蛋白的基因，且有研究表明即使是瞬間經(jīng)歷缺氧，腫瘤細胞對離體基底膜的侵襲力亦增加〔3〕，而本研究表明HIF-1α亦可能通過對參與腫瘤轉(zhuǎn)移侵襲相關(guān)蛋白的基因調(diào)控，而對大腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移過程起重要作用。

本研究分析表明在大腸癌的發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移過程中兩者可能起協(xié)同作用，考慮聯(lián)合應(yīng)用HSP90及HIF-1α的抑制劑可能會進一步提高大腸癌的治療效果。

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〔2014-08-17修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)

通訊作者:熊枝繁(1962-)，男，碩士，主任醫(yī)師，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事細胞因子與消化道腫瘤的關(guān)系研究。

基金項目:湖北省科技計劃自然科學(xué)基金課題(2011CDB368)

〔文章編號〕1005-9202(2015)20-5733-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2015. 20. 022

〔文獻標(biāo)識碼〕A

〔中圖分類號〕R574. 6