陳慧勤　(泉州醫(yī)學高等專科學校，福建　泉州　362000)

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慢性低氧及野百合堿對SD大鼠右心室功能及規(guī)范性瞬時感受器電位亞家族表達的影響

陳慧勤(泉州醫(yī)學高等專科學校，福建泉州362000)

〔摘要〕目的探討慢性低氧(CH)及野百合堿(MCT)對SD大鼠右心室功能及右心室心肌細胞上規(guī)范性瞬時感受器電位(TRPC)亞家族表達的變化。方法將72只SD雄性大鼠隨機平均分為對照組(CON組)、CH組和MCT誘導右心室肥大模型組(MCT組)，每組24只。CH組將大鼠置于CH(10%O2)環(huán)境飼養(yǎng)3 w以誘導大鼠發(fā)生右心室肥厚，MCT組則是對SD大鼠進行腹腔注射誘導液，其劑量規(guī)定是2%MCT 60 mg/kg，設(shè)計MCT誘導大鼠出現(xiàn)右心室肥厚模型。之后對上述三組SD大鼠的右心室進行全面檢查，研究其血流動力學指標和右心肥大指數(shù)(RVMI)、右心室心肌病理切片，實時定量PCR法和免疫印跡法檢測TRPC亞家族mRNA和相關(guān)蛋白的表達水平。結(jié)果與CON組比較，CH組及MCT組: SD大鼠的右心室功能相關(guān)指標收縮壓(RVSP)、右心室內(nèi)壓力最大上升速率(+dp/dtmax)、RVMI均顯著增加(P＜0. 01)，且MCT組的血流動力學改變及RVMI均顯著高于CH組;心肌纖維組織呈病態(tài)狀，纖維層變厚，胞核顏色加重、外形不規(guī)則，同時經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，MCT組的病理改變較CH組更為顯著; CH組右心室心肌組織TRPC1 mRNA表達升高; MCT組右心室心肌組織TRPC6 mRNA表達升高; CH組大鼠右心室TRPC1蛋白指數(shù)異常，其表達率增加，MCT組大鼠右心室TRPC6蛋白指數(shù)異常，其表達率增加(P＜0. 05)。結(jié)論在CH環(huán)境中生長3 w能夠順利誘導大鼠出現(xiàn)右心室肥厚，同時也會提高其心肌細胞中的TRPC1 mRNA與蛋白的表達，MCT預(yù)處理3 w可成功誘導SD大鼠產(chǎn)生右心室心肌肥厚，且MCT預(yù)處理的誘導的右心室肥厚現(xiàn)象比較明顯，同時也提高其心肌細胞中的TRPC6 mRNA與蛋白的表達，這兩個亞型或許是誘導右心室肥厚出現(xiàn)的重要因素。

〔關(guān)鍵詞〕慢性低氧;野百合堿;規(guī)范性瞬時感受器電位;心肌肥厚; Ca2+

心肌肥厚是老年人死亡率增高的獨立危險因素〔1〕。規(guī)范性瞬間感受器電位(TRPC)亞家族一員TRPC1～7和鈣離子內(nèi)流密切相關(guān)，它們可以改變細胞內(nèi)外的鈣離子濃度，同時也會造成細胞的增殖與凋亡等〔2〕。本研究分別選用慢性低氧(CH)及野百合堿(MCT)誘導的大鼠右心室肥大模型，模擬肺心病的急性發(fā)作，對比在CH環(huán)境下、MCT誘導大鼠右心室肥厚模型的心肌細胞上，發(fā)生的鈣離子內(nèi)流且心肌肥厚是哪一個TRPC亞型影響的。

1　資料與方法

1. 1藥品和儀器試劑有: ROX(Roche，澳大利亞)、Trizol(Invitrogen，英國)、逆轉(zhuǎn)錄試劑儀(Takara，德國)、引物(江蘇生物工程有限公司)、PMSF(碧云天，貴州)、RIPA(碧云天，貴州)、化學發(fā)光試劑Novex ECL(BioSpherix，日本)、兔抗大鼠TRPC6抗體(Heraeus，美國)、兔抗大鼠TRPC1抗體(Abcam，德國)、小鼠抗大鼠β-actin抗體(Abcam，俄羅斯)、MCT(Sigma，瑞士)，其他分析純是國產(chǎn)訂購。儀器:氧氣濃度探測頭(E702型，德國Invitrogen企業(yè))、氧氣濃度分析器(ProOX-110型，德國Invitrogen企業(yè))、壓力轉(zhuǎn)換儀(YPJ01型，南京醫(yī)療器械公司)、生物信號采集運作系統(tǒng)(RM6240型，南京醫(yī)療器械公司)、冷凍高速離心器(日本Abcam企業(yè))、StepOne實時PCR器(ABI企業(yè)，德國)、Mini-Protean Tetra電泳槽(Bio-Rad企業(yè)，日本)、BIO-RAD Mini Trans-Blot Cell小型轉(zhuǎn)印槽(Bio-Rad企業(yè)，日本)。

1. 2組建慢性低氧誘導的大鼠模型隨機選出72只健康雄性SD大鼠，重量范圍控制在180～220 g之間(由南京斯萊克實驗動物飼養(yǎng)單位提供)，自動分為三個實驗組，其分別是參照組(CON組)、CH組和MCT組，每組24只。CON組:大鼠在正常環(huán)境下不間斷喂養(yǎng)3 w; CH組:大鼠在常壓低氧的盒子里不間斷喂養(yǎng)3 w，低氧盒中的空氣成分添加了N2，確保O2濃度控制在9. 8%～10. 2%范圍內(nèi); MCT組:給SD大鼠一次性腹腔注射2%MCT 60 mg/kg，設(shè)計MCT誘導大鼠出現(xiàn)右心室肥厚模型。CH及MCT給藥3 w對大鼠右心室血流動力學、肥厚參數(shù)、病理組織形態(tài)的影響。

1. 3血流動力學參數(shù)的測算各組SD大鼠均通過腹腔注射肝素(Heparin，50 IU/100 g)，5 min之后經(jīng)腹腔注射麻藥氨基甲酸乙酯(1 g/kg)。然后將靜脈管由右頸插入右心室(RV)內(nèi)，詳細觀察SD大鼠RV收縮壓(RVSP)、心率(HR)和右心室內(nèi)壓力最大/最小上升速率(RV±dp/dtmax)，后經(jīng)左頸總動脈插管記錄平均體循環(huán)動脈壓(mSAP)。

1. 4 RVMI的測算將靜脈管插入RV之后，立即打開大鼠胸腔，對心臟進行解剖，順著心房交叉端切掉兩心房與大動脈，然后將左右心室與室間隔(LV+S)逐一分離出來，并吸干表層水分，測凈重，可通過公式RVMI=RV/(LV+S)計算得出。

1. 5心室肌組織形態(tài)學測算將麻醉后的SD大鼠解剖，拿出心臟，將周邊的血管、脂肪層、心包膜等組織剪去，并吸干表層水分，將RV心肌接近心尖的一端切割出來，放在4%甲醛溶液內(nèi)浸泡，然后選用普通石蠟進行埋藏，通過HE染色心肌組織，進行切片處理，之后用光鏡來觀察心室肌病理組織的變化。

1. 6 R-T PCR分析TRPC1/3/4/5/6/7 mRNA的表達取出凈重是0. 1 g的左/右心室組織置于液氮內(nèi)磨成粉末狀，然后取出TRIzol試劑來篩選出總RNA量，用紫外分光光度法測算，得出RNA的濃度和純度。根據(jù)Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明步驟來做RT-PCR。其內(nèi)參考標準選定β-actin，并對PCR進行實時定量，設(shè)計10 μl PCR反應(yīng)系統(tǒng): PCR正義鏈引物、ROX、PCR反義鏈引物、cDNA和H2O的體積各是0. 3 μl、5 μl、0. 3 μl、0. 25 μl和4. 15 μl，從而實現(xiàn)PCR的擴增，此反應(yīng)包括兩個步驟:①預(yù)變性:放置在95℃環(huán)境下約為10 min(1個循環(huán));②變性、降火、延展放置在95℃環(huán)境下約為30 s，放置在60℃環(huán)境下約為1 min(40個循環(huán))。引物序列見表1。

1. 7 Western印跡分析TRPC1、TRPC6蛋白的表達將右心室心肌組織置于液氮內(nèi)磨成粉末狀，用RIPA溶液進行細胞裂解，從而篩選出總蛋白，通過BCA方法計算其濃度，然后選用40 μg總蛋白做Western印跡。設(shè)定電泳液是12. 5%，之后進行轉(zhuǎn)膜印跡，實現(xiàn)和膜抗原融合，其抗體共有3個，即兔抗大鼠TRPC1抗體、小鼠抗大鼠β-actin抗體與兔抗大鼠TRPC6抗體，再將辣根過氧化物酶(HRP)耦聯(lián)的二抗與此抗體進行結(jié)合發(fā)生聯(lián)合反應(yīng)，然后經(jīng)化學發(fā)光試劑Novex EC來測算，再將壓片曝光，然后實現(xiàn)顯影與定影。最后繪制Phoretix ID圖來研究相關(guān)蛋白的表達水平。

1. 8統(tǒng)計學方法采用Origin 6. 1軟件進行單因素方差分析。

表1　 β-actin和TRPC亞家族的mRNA引物

2　結(jié)果

2. 1 RV血流動力學與心室肥厚的情況與CON組比較: CH組、MCT組RVSP、RV+dp/dtmax、RVMI顯著升高，RV-dp/dtmax顯著下降(P＜0. 01)，且MCT組較CON組升高程度更為顯著，3組間mSAP差異無統(tǒng)計學意義(P＞0. 05)，見表2。與CON組RVMI(28. 20±4. 39)比較，CH組和MCT組RVMI均明顯增高〔(37. 59±4. 80)、(51. 06±9. 62)，P＜0. 01〕，說明在CH環(huán)境下生存3 w能夠讓SD大鼠出現(xiàn)右心室肥厚，且明顯提高RVSP;由此可以看出CH組和MCT組都能夠讓大鼠出現(xiàn)右心室肥厚，同時提高RVSP。

表2　右心室血流動力學參數(shù)比較(x ±s，n=24)

2. 2病理組織形態(tài)變化對比圖1可見，經(jīng)過HE染色之后，通過光鏡觀察CON組大鼠心肌細胞排列規(guī)則，胞核界限分明。CH組和MCT組大鼠心肌細胞纖維層變厚，肌原纖維量提升，心肌纖維排序雜亂，胞核顏色加重、外形不規(guī)則，且MCT組心肌纖維、細胞核的排列更為紊亂，心肌細胞增生更明顯。

圖1　各組大鼠右心室心肌組織病理切片(HE，×400)

2. 3 CH及MCT誘導3 w對右心室心肌組織TRPC亞家族mRNA表達的影響CH組右心室心肌細胞上TRPC1 mRNA相對表達顯著升高(P＜0. 05，n = 6); MCT組右心室心肌細胞上TRPC6 mRNA相對表達顯著升高(P＜0. 05)，見表3。

2. 4在CH環(huán)境下及MCT誘導生存3 w對右心室心肌組織TRPC1蛋白表達的影響CH組大鼠右心室TRPC1蛋白表達明顯增強，其變化幅度是由(1. 00±0. 62)增加到(2. 02±0. 47)(P＜0. 05，n = 4);見圖2，而TRPC6蛋白表達的變化幅度由(1. 00±0. 46)至(2. 90±0. 32)(P＜0. 05，n=4)，見圖3。

表3　各組大鼠右心室TRPC亞家族mRNA相對表達狀況(x±s，n=6)

圖2　 Western印跡法檢測TRPC1蛋白在各組大鼠右心室心肌組織的表達

圖3　 Western印跡法檢測TRPC6蛋白在各組大鼠右心室心肌組織的表達

3　討論

CH及MCT誘導右心室心肌肥厚的機制為:基于應(yīng)激原因的考慮，在CH環(huán)境下能夠?qū)ι眢w的各項組織及器官的發(fā)育帶來影響，尤其是會直接影響到心血管系統(tǒng)的代謝及發(fā)育。血管內(nèi)皮細胞損傷是CH引起的首要副作用，除此以外，多種縮血管的物質(zhì)釋放會引起血管阻力增加，并且，氧濃度弱的情況下還會提高內(nèi)皮素(ET)-1，5-HT等收縮血管因子的活性，致使肺動脈出現(xiàn)痙攣和肌細胞增生，致使肺動脈狹窄〔3〕。肺循環(huán)阻力增加時，右心發(fā)揮其代償功能從而發(fā)生右心室肥大。而MCT誘導3 w的方法其實是參考了Tofovic等〔4〕的實驗原理，通過此分析可以看出MCT給藥后大鼠的心肌肥厚模型可以模擬人類肺心病的發(fā)病過程。MCT屬雙稠吡咯啶生物堿，該物質(zhì)可在肝臟內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化為有活性的野百合堿吡咯，特異性地使得肺動脈內(nèi)皮細胞損傷，增加收縮血管因子有: ET、血小板源性生長因子(PDGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)等含量的增加，以此造成肺動脈血管收縮變細，導致凋零的內(nèi)皮細胞瞬間激活內(nèi)外源性凝血路徑，以此出現(xiàn)腦血栓，從而導致病情更為復雜〔5〕。本實驗選擇的兩組造模方式最為合理，其重復性控制得當。

研究發(fā)現(xiàn)在TRPC亞家族成員可以在大鼠心肌細胞里實現(xiàn)顯著表達，TRPC亞家族與心肌肥厚的發(fā)生具有相關(guān)性，尤其是TRPC1、TRPC3和TRPC6通道在心肌肥厚中扮演了重要的角色〔6〕。在大鼠心肌細胞上TRPC3基因的表達量最多，TRPC1 與TRPC6緊隨其后〔7〕。Seth等〔8〕發(fā)現(xiàn)TRPC1基因敲除、Onohara等〔9〕發(fā)現(xiàn)TRPC3基因沉默或TRPC6基因沉默都可阻礙心肌肥厚的出現(xiàn)，Vindis等〔10〕研究得出由5-HT給藥的大鼠心肌肥厚的心肌細胞里的TRPC1表達有了明顯地提升，不過通過siRNA能明顯減弱TRPC1蛋白的表達，同時也可以避免活化T細胞核因子(NFAT)的再生，以此可以有效地控制經(jīng)5-HT給藥出現(xiàn)的心肌肥厚。Kinoshita等〔11〕通過實驗得出GC-A基因斷裂以后，實驗小鼠體內(nèi)沒有了GC-A對TRPC6的阻礙，那么會導致心肌細胞中CaN/NFAT信號路徑被打開，以此造成心肌肥厚的出現(xiàn)。本實驗?zāi)Ｐ团c之完全不同，它研究的是在CH環(huán)境下及經(jīng)MCT給藥大鼠心肌肥厚模型，從而明確了TPRC1與TPRC6蛋白基因表達的提升或許和心肌肥厚有密切的聯(lián)系。

4參考文獻

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〔2014-09-18修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)

基金項目:福建省教育廳課題(JA15717);泉州市科技計劃項目(2015Z98)

〔文章編號〕1005-9202(2015)20-5725-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2015. 20. 019

〔文獻標識碼〕A

〔中圖分類號〕R363

第一作者:陳慧勤(1982-)，女，講師，碩士，主要從事心血管病研究。