齊亞靈　趙文杰　王偉群楊廣民時(shí)　陽方艷秋鐘南田　洪　燈　張彥慧　周　雯　符皎榮(海南醫(yī)學(xué)院，海南　?？凇?799)

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共表達(dá)pcIL-18/MAGE-1DNA疫苗對(duì)JEG-3細(xì)胞HLA-G基因表達(dá)的影響

齊亞靈趙文杰王偉群1楊廣民2時(shí)陽2方艷秋2鐘南田洪燈張彥慧周雯符皎榮
(海南醫(yī)學(xué)院，海南?？?71199)

〔摘要〕目的觀察共表達(dá)基因疫苗pcIL-18/MAGE-1對(duì)絨癌JEG-3細(xì)胞株HLA-G基因表達(dá)的影響，探究pcIL-18/MAGE-1抗腫瘤作用機(jī)制。方法應(yīng)用構(gòu)建的共表達(dá)pc IL-18/MAGE-1 DNA疫苗免疫小鼠，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，免疫后分別收集脾細(xì)胞，作用于靶細(xì)胞JEG-3，應(yīng)用FCM檢測(cè)小鼠T細(xì)胞亞群情況及NK細(xì)胞活性，MTT法檢測(cè)腫瘤特異性CTL對(duì)靶細(xì)胞的殺傷率，RT-PCR法檢測(cè)HLA-G基因表達(dá)情況。結(jié)果免疫組HLA-G基因表達(dá)降低，且對(duì)JEG-3細(xì)胞殺傷活性增加，與對(duì)照組比較，差異顯著(P＜0. 05)。免疫組NK細(xì)胞活性及CD4+/CD8+、CD8+、CD4+值均高于對(duì)照組(P＜0. 05)。結(jié)論共表達(dá)基因疫苗pcIL-18/MAGE-1通過降低HLA-G基因的表達(dá)，進(jìn)而增加NK細(xì)胞活性以及誘導(dǎo)腫瘤特異性CTL直接殺傷腫瘤細(xì)胞，發(fā)揮抗腫瘤作用。

〔關(guān)鍵詞〕MAGE-1; IL-18;絨癌; JEG-3細(xì)胞株;人類白細(xì)胞抗原-G

1佳木斯大學(xué)2吉林省人民醫(yī)院腫瘤生物治療中心

第一作者:齊亞靈(1967-)，女，教授，醫(yī)學(xué)博士，博士生導(dǎo)師，主要從事腫瘤基因診斷與生物治療研究。

pcIL-18-MAGE-1共表達(dá)基因疫苗接種免疫后小鼠脾細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，作用于肝癌SMMC-7721和Hepal-6細(xì)胞株，證實(shí)該疫苗通過同時(shí)激活CD4+T細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞、增加NK細(xì)胞活性及誘導(dǎo)腫瘤特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)直接殺傷腫瘤細(xì)胞〔1〕;體內(nèi)試驗(yàn)證實(shí)pcIL-18-MAGE共表達(dá)基因疫苗對(duì)荷瘤鼠具有一定抗腫瘤作用〔2〕。本文觀察pcIL-18-MAGE-1共表達(dá)基因疫苗對(duì)JEG-3細(xì)胞人類白細(xì)胞抗原(HLA)-G基因表達(dá)的影響，進(jìn)一步探究pcIL-18/MAGE-1抗腫瘤作用機(jī)制。

1　材料與方法

1. 1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、細(xì)胞株、質(zhì)粒清潔級(jí)雌性C57BL/6J小鼠(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所)，體重(20±2)g，自由食水，無菌動(dòng)物室飼養(yǎng)。質(zhì)粒pcIL-18-pcMAGE-1、pcDNA3、絨癌JEG-3細(xì)胞株(吉林省人民醫(yī)院腫瘤生物治療中心提供)。

1. 2主要試劑胎牛血清、IMDM細(xì)胞培養(yǎng)液、淋巴細(xì)胞分離液(PAA)、3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、3%氫氧化鋁(武漢博士德公司)。異硫氰酸熒光素(FITC)與PE標(biāo)記的羊抗鼠CD4+、CD8+單抗、FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG單抗、HLA-G單抗(美國Immunotech公司)，Trizol試劑盒、RT-PCR試劑盒(武漢陽達(dá)生物科技有限公司)，引物(上海生工生物公司)。

1. 3免疫方法及實(shí)驗(yàn)分組小鼠大腿內(nèi)側(cè)肌群肌肉注射:疫苗免疫組〔100 μg(0. 4 ml 3%氫氧化鋁膠)pcIL-18-pcMAGE-1〕、陰性對(duì)照組(等量pcDNA3)及空白對(duì)照組(等量0. 9%NaCl無菌水溶液)。1次/10 d，3次，末次注射7 d后，斷頭處死小鼠，將取出的脾臟浸入細(xì)胞培養(yǎng)液中研磨，200目濾網(wǎng)過濾，收集脾細(xì)胞備用。

1. 4流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)NK細(xì)胞活性及T細(xì)胞亞群每組分別取1×106個(gè)小鼠脾細(xì)胞，0. 1 mol/L PBS×2次，加入單抗10 μl，室溫避光，20 min。PBS×2次，加0. 5 ml PBS混勻，10 min后，上機(jī)檢測(cè)。

1. 5 MTT法檢測(cè)小鼠脾細(xì)胞對(duì)JEG-3細(xì)胞殺傷率將JEG-3細(xì)胞加入96孔板中，每孔4×104個(gè)細(xì)胞，貼壁后，分別加入空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組及疫苗免疫組的4×106個(gè)效應(yīng)脾細(xì)胞，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育12 h;棄掉培養(yǎng)基及懸浮細(xì)胞，每孔加50 μl 0. 5 mg/ml MTT，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育4 h，棄上清，加100 μl DMSO，震蕩10 min，酶標(biāo)儀在570 nm處測(cè)吸光度值(OD值)。殺傷率(%)= 1－OD(效應(yīng)細(xì)胞+靶細(xì)胞)－OD效應(yīng)細(xì)胞×100%。OD靶細(xì)胞

1. 6 RT-PCR技術(shù)檢測(cè)HLA-G基因表達(dá)情況將JEG-3細(xì)胞加入96孔板中(4×104個(gè)細(xì)胞/每孔)，貼壁后，將收集的陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組及疫苗免疫組效應(yīng)脾細(xì)胞(4×106個(gè)細(xì)胞/每孔)加入，同時(shí)設(shè)不加脾細(xì)胞的常規(guī)培養(yǎng)的JEG-3細(xì)胞為陽性對(duì)照組。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育24 h;棄掉培養(yǎng)基，分離收集JEG-3細(xì)胞，用Trizol試劑盒提取細(xì)胞總RNA、RT-PCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳，應(yīng)用凝膠分析系統(tǒng)對(duì)擴(kuò)增條帶進(jìn)行密度分析，用平均灰度值代表相應(yīng)基因的表達(dá)量。參照文獻(xiàn)〔3〕設(shè)計(jì)引物序列及反應(yīng)體系，β-actin產(chǎn)物為619 bp，HLA-G產(chǎn)物為770 bp。mRNA的相對(duì)表達(dá)量=HLA-G平均灰度值/βactin平均灰度值。

1. 7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS19. 0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2　結(jié)果

2. 1 FCM檢測(cè)結(jié)果與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組比較，疫苗免疫組脾細(xì)胞中CD4+/CD8+比值及CD8+、CD4+細(xì)胞比例及NK細(xì)胞活性顯著增高(P＜0. 01，P＜0. 05)。陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組差異不顯著(P＞0. 05)。見表1。

表1　各組細(xì)胞亞群和NK細(xì)胞活性比較(n=10，x ±s)

2. 2 MTT法檢測(cè)結(jié)果疫苗免疫組殺傷率(22. 1%±2. 3%)最高，與陰性對(duì)照組(14. 1%±1. 2%)和空白對(duì)照組(13. 1%± 1. 3%)差異顯著(P＜0. 05)。

2. 3 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，各組JEG-3細(xì)胞中均有HLA-G基因表達(dá)，陽性對(duì)照組、空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組HLA-G基因表達(dá)無明顯差異，疫苗免疫組HLA-G基因表達(dá)水平明顯降低(P＜0. 05)，見圖1。

3　討論

機(jī)體內(nèi)具有免疫監(jiān)視作用的主要效應(yīng)細(xì)胞有CTL細(xì)胞和

圖1　各組HLA-G mRNA表達(dá)RT-PCR結(jié)果

M. Marker; 1.空白對(duì)照組; 2.陽性對(duì)照組; 3.陰性對(duì)照組; 4.疫苗免疫組NK細(xì)胞，CTL細(xì)胞主要通過識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面的MHC-I類分子，殺傷腫瘤細(xì)胞;對(duì)于不表達(dá)MHC-I類分子的腫瘤細(xì)胞，NK細(xì)胞直接殺傷。為了觀察共表達(dá)pc IL-18/MAGE-1 DNA疫苗對(duì)JEG-3細(xì)胞是否具有殺傷作用，我們應(yīng)用構(gòu)建的共表達(dá)pc IL-18/MAGE-1 DNA疫苗免疫小鼠，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，免疫后分別收集脾細(xì)胞，作用于絨癌JEG-3細(xì)胞，應(yīng)用FCM檢測(cè)小鼠T細(xì)胞亞群情況及NK細(xì)胞活性，MTT法檢測(cè)腫瘤特異性CTL對(duì)靶細(xì)胞的殺傷率，結(jié)果表明，構(gòu)建的pc IL-18/MAGE-1 DNA疫苗通過同時(shí)激活CD4+T細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞、增加NK細(xì)胞活性以及誘導(dǎo)腫瘤特異性CTL直接抑制絨癌JEG-3細(xì)胞的增殖。

腫瘤細(xì)胞具有免疫逃逸功能，通過MHC-I類分子的變構(gòu)和丟失或高表達(dá)HLA-G分子逃避CTL和NK細(xì)胞的殺傷作用。非經(jīng)典的HLA-I類抗原——人類白細(xì)胞抗原-G(HLA-G)，是機(jī)體內(nèi)重要的免疫耐受分子，HLA-G分子通過與免疫細(xì)胞上的抑制性受體:免疫球蛋白樣轉(zhuǎn)錄物2、免疫球蛋白樣轉(zhuǎn)錄物4及殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體KIR相互作用直接抑制CTL和NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷活性〔4〕;通過誘導(dǎo)產(chǎn)生多種調(diào)節(jié)性細(xì)胞及細(xì)胞因子等間接發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)〔5〕，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸。HLA-G在人類乳腺癌、結(jié)腸癌、肝癌、腎癌、肺癌等組織中可表達(dá)HLA-G，并具有腫瘤特異性〔6，7〕，HLA-G在絨癌JEG-3細(xì)胞株中呈現(xiàn)高表達(dá)〔8〕。本文結(jié)果表明疫苗免疫后的效應(yīng)細(xì)胞可以降低JEG-3細(xì)胞HLA-G基因表達(dá)。推測(cè)，共表達(dá)pcIL-18/MAGE-1 DNA疫苗對(duì)JEG-3細(xì)胞增殖抑制作用，是通過降低HLA-G基因表達(dá)，進(jìn)而增加NK細(xì)胞活性及誘導(dǎo)腫瘤特異性CTL途徑實(shí)現(xiàn)的，具體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有待進(jìn)一步研究。

4參考文獻(xiàn)

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〔2014-10-19修回〕

(編輯苑云杰)

通訊作者:方艷秋(1968-)，女，主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，主要從事腫瘤生物治療研究。

基金項(xiàng)目:海南省自然科學(xué)基金(No．310051)

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2015)20-5723-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2015. 20. 018

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔中圖分類號(hào)〕R735. 7