韓　冰　(沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院消化內(nèi)科，遼寧　沈陽　110024)

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環(huán)氧合酶-2抑制劑降低結(jié)腸癌細(xì)胞血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)的影響及機(jī)制

韓冰(沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院消化內(nèi)科，遼寧沈陽110024)

〔摘要〕目的探討選擇性環(huán)氧合酶(COX)-2抑制劑celecoxib影響結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達(dá)的機(jī)制。方法體外培養(yǎng)結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞，采用MTT法檢測celecoxib對HT-29細(xì)胞增殖的影響。同時(shí)針對Sp1和Sp4進(jìn)行RNA干擾，應(yīng)用RT-PCR和Western印跡法聯(lián)合檢測celecoxib組和干擾組對HT-29細(xì)胞Sp1、Sp4和VEGF mRNA和蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果隨著藥物濃度的增加(5、10、20、40和80 μmol/L)和作用時(shí)間的延長(2、4、8、16和32 h)，celecoxib對HT-29細(xì)胞的增殖具有顯著抑制作用，在2、4、8、16和32 h時(shí)的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為40. 36、33. 15、31. 67、30. 94和31. 54 μmol/L。RT-PCR和Western印跡檢測顯示，celecoxib可顯著降低HT-29細(xì)胞Sp1、Sp4和VEGF mRNA和蛋白的表達(dá)水平，同時(shí)經(jīng)RNA干擾Sp1(Sp4)后，HT-29細(xì)胞Sp1(Sp4)和VEGF mRNA和蛋白的表達(dá)水平明顯降低，但Sp4(Sp1)mRNA和蛋白表達(dá)變化不明顯。結(jié)論celecoxib可抑制結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞增殖，其作用機(jī)制可能是通過下調(diào)Sp1和Sp4表達(dá)水平而降低結(jié)腸癌細(xì)胞中VEGF的表達(dá)水平。

〔關(guān)鍵詞〕環(huán)氧合酶-2;結(jié)腸癌; Sp1; Sp4;血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)

結(jié)腸癌以淋巴道轉(zhuǎn)移為主，發(fā)病率較高且較早，由于缺乏特異、敏感的診斷和生物防治的指標(biāo)與方法，發(fā)現(xiàn)時(shí)往往為中晚期，生存率為33%。環(huán)氧合酶(COX)是花生四烯酸代謝過程中一個重要的限速酶，其中COX-2是前列腺素合成的限速酶，在正常組織中檢測不到，而在炎癥和腫瘤中表達(dá)量迅速增高，被認(rèn)為與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)〔1〕。作為COX-2的選擇性抑制劑，非甾體類抗炎藥塞來昔布(celecoxib)可以抑制多種腫瘤細(xì)胞中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達(dá)，從而抑制腫瘤的形成、轉(zhuǎn)移和浸潤〔2，3〕。本研究觀察celecoxib對結(jié)腸癌細(xì)胞Sp1、Sp4和VEGF表達(dá)的影響及機(jī)制。

1　材料與方法

1. 1材料人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞系購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所;胎牛血清和McCoy 5A培養(yǎng)基購自Gibco公司;青霉素和硫酸鏈霉素購自美國Sigma公司; CCK-8試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所; Trizol和lipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司;細(xì)胞蛋白提取試劑盒購自碧云天生物有限公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR?Premix Ex TaqTM購自TAKARA公司;辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG購自北京鼎國昌盛有限公司; β-tubulin、Sp1、Sp4和VEGF抗體購自Abcam公司。

1. 2細(xì)胞培養(yǎng)HT-29細(xì)胞用含10%滅活胎牛血清，100 U/ml青霉素和100 U/ml硫酸鏈霉素的McCoy 5A細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，調(diào)整合適濃度加到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，1～2 d換液，待培養(yǎng)瓶內(nèi)細(xì)胞生長至80%后備用。

1. 3細(xì)胞增殖活性分析將1×104的HT-29細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h，實(shí)驗(yàn)組(添加終濃度5、10、20、40、80 μmol/L的celecoxib)，同時(shí)設(shè)對照組，每組重復(fù)3孔。分別于2、4、8、16、32 h后，加MTT液(5 mg/ml)20 μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄上清液，加入150 μl/孔二甲基亞砜(DMSO－)振蕩混勻10 min，使藍(lán)紫色沉淀充分溶解，選擇490 nm波長，在全自動酶標(biāo)儀上測定吸光度A值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。平均細(xì)胞生長抑制率(%)=(1－A實(shí)驗(yàn)組/A對照組)×100%。

1. 4 siRNA的設(shè)計(jì)、合成與轉(zhuǎn)染根據(jù)美國國立生物技術(shù)信息中心NCBI數(shù)據(jù)庫中Sp1和Sp4基因序列及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道設(shè)計(jì)針對Sp1和Sp4 siRNA〔4〕，引物序列，Sp1正義鏈5'-AUCACUCCAUGGAUGAAAUGATT-3'，反義鏈5'-UCAUUUCAUCCAUGGAGUGAUTT-3'。Sp4正義鏈5'-GCAGUGACACAUUAGUGAGCTT-3'，反義鏈5'-GCUCACUAAUGUGUCACUGCTT-3'。均由生工生物工程(上海)有限公司合成。HT-29細(xì)胞按2×105個/孔接于24孔板中，細(xì)胞生長至80%后利用lipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染siRNA至HT-29細(xì)胞，使siRNA終濃度達(dá)到50 nmol/L。置于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。

1. 5 RT-PCR檢測細(xì)胞Sp1、Sp4和VEGF mRNA的表達(dá)收集各處理組細(xì)胞，利用Trizol法提取各處理組細(xì)胞總RNA，以Gapdh為內(nèi)參，二步法RT-PCR檢測Sp1、Sp4和VEGF mRNA的表達(dá)。引物序列，VEGF正義鏈5'-CCATGAACTTTCTGCTGTCTT-3'，反義鏈5'-ATCGCATCAGGGGCACACAG-3'; Sp1正義鏈5'-GGAGTTGGTGGCAATAATGGG-3'，反義鏈5'-TGGTTCTGTAAGTTGGGAGCGG-3'; Sp4正義鏈5'-CCAGCAGTAATAACGGGAGTGC-3'，反義鏈5'-AAGTAGTGGTGTTGGTGGGTGTG-3'; Gapdh正義鏈5'-AATCCCATCACCATCTTCCA-3'，反義鏈5'-GTCATCATATTTGGCAGGTT-3'。各引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成。25 μl反應(yīng)體系為: 2×SYBR?Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)12. 5 μl;上、下游引物各0. 5 μl; 50×ROX Reference DyeⅡ1 μl; DNA模板2 μl;補(bǔ)充滅菌超純水至25 μl。反應(yīng)條件為: 95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火34 s，72℃延伸30 s，共40個循環(huán); 72℃延伸10 min; 95℃變性15 s，60℃退火1 min，72℃延伸30 s，循環(huán)1次得到溶解曲線。

1. 6 Western印跡法檢測細(xì)胞Sp1、Sp4和VEGF蛋白的表達(dá)收集各處理組細(xì)胞，利用細(xì)胞蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞內(nèi)總蛋白，經(jīng)12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，然后用3. 7%脫脂奶粉4℃封閉過夜，封閉結(jié)束后，向轉(zhuǎn)移膜滴加抗體(用封閉液1∶400稀釋鼠源單克隆抗體:β-tubulin、Sp1、Sp4和VEGF)，室溫孵育2 h。磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)洗滌3次，每次5 min。辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG(封閉液1∶5 000稀釋)室溫孵育1 h。孵育結(jié)束后，取出膜用PBST洗滌3次，每次5 min。采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯色。

1. 7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS19. 0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2　結(jié)果

2. 1 celecoxib對HT-29細(xì)胞增殖抑制作用各種劑量組celecoxib在各個時(shí)間點(diǎn)對HT-29細(xì)胞增殖具有一定的抑制作用。同時(shí)，這種抑制作用具有時(shí)間依賴性，除5 mg/L劑量組外，其他各劑量組隨作用時(shí)間的延長，抑制作用增強(qiáng)，雖然有時(shí)處于平穩(wěn)抑制作用或呈下降趨勢，但這種變化并沒有顯著差異。celecoxib對HT-29細(xì)胞增殖的抑制作用也具有明顯濃度依賴性，從5 μmol/L起對HT-29細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)逐漸顯著增加。見表1。celecoxib在2、4、8、16、32 h時(shí)的半數(shù)抑制濃度IC50分別為40. 36、33. 15、31. 67、30. 94、31. 54 μmol/L。

2. 2 HT-29細(xì)胞Sp1、Sp4和VEGF mRNA和蛋白表達(dá)的變化celecoxib可顯著降低HT-29細(xì)胞Sp1、Sp4和VEGF mRNA和蛋白的表達(dá)，同時(shí)RNA干擾Sp1后，HT-29細(xì)胞Sp1和VEGF mRNA和蛋白的表達(dá)明顯降低，但Sp4 mRNA和蛋白表達(dá)不變，而RNA干擾Sp4后，HT-29細(xì)胞Sp4和VEGF mRNA和蛋白的表達(dá)明顯降低，但Sp1 mRNA和蛋白表達(dá)不變。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，celecoxib組VEGF mRNA和蛋白的表達(dá)降低程度明顯高于Sp1和Sp4 RNA干擾組，但Sp1 RNA干擾組和Sp4 RNA干擾組之間VEGF mRNA和蛋白的表達(dá)降低程度沒有差異。見表2和圖1。

表1　不同劑量celecoxib對HT-29細(xì)胞增殖的抑制作用(x±s，%)

表2　不同處理HT-29細(xì)胞Sp1、Sp4和VEGF mRNA表達(dá)的變化(x±s)

圖1　不同處理HT-29細(xì)胞Sp1、Sp4和VEGF蛋白表達(dá)的變化

3　討論

美國2007年的統(tǒng)計(jì)表明，結(jié)腸癌是排在第三位的最常見腫瘤，每年大約有11. 234萬人新發(fā)病，其中有5. 218萬人死亡，而結(jié)腸癌在我國已由10年前列惡性腫瘤的第6位上升到目前的第4位〔5〕。轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的重要生物學(xué)特征，被認(rèn)為是腫瘤難以治愈的首要因素之一。結(jié)腸癌的局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是最常見的現(xiàn)象，常導(dǎo)致患者治療效果不佳，雖然對于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制尚不清楚，但腫瘤淋巴管的生成不僅是腫瘤生長所必需的，而且也被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的助推器。

腫瘤淋巴管的生長是腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的毛細(xì)血管生長及腫瘤血液循環(huán)建立的過程，此過程涉及多種促血管生成因子、抑制因子、酶類和細(xì)胞黏附因子。其中VEGF是最早發(fā)現(xiàn)，也是目前為止發(fā)現(xiàn)的最具特異性的淋巴管內(nèi)皮生長刺激因子。VEGF 是VEGF家族中的一員，被認(rèn)為是重要的促淋巴管生長因子，正常組織情況下，VEGF表達(dá)水平相對較低，但在炎癥和腫瘤等某些病理情況下，VEGF在許多腫瘤組織中呈過量表達(dá)狀態(tài)。VEGF在許多腫瘤新生血管形成中起著關(guān)鍵作用，與腫瘤的浸潤、淋巴道轉(zhuǎn)移和預(yù)后顯著相關(guān)，可能成為臨床干預(yù)與治療的新靶點(diǎn)〔6〕。本研究也表明VEGF在結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞中高表達(dá)。

COX有兩種異構(gòu)酶，其中COX-1是結(jié)構(gòu)酶，存在于大多數(shù)細(xì)胞和組織中。COX-2為誘導(dǎo)酶，存在于多種組織與細(xì)胞中，但在正常生理狀態(tài)下很少表達(dá)，在組織損傷和炎癥等及腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，可以迅速地被誘導(dǎo)、表達(dá)增強(qiáng)。目前認(rèn)為COX-2可通過多種途徑促進(jìn)腫瘤血管的生成。COX-2在絕大多數(shù)人類腫瘤中過表達(dá)，而且其過表達(dá)與結(jié)腸癌、頭頸部腫瘤、肺癌、前列腺癌、胃癌、乳腺癌等腫瘤的浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良有關(guān)〔7〕。COX-2表達(dá)增強(qiáng)在消化系統(tǒng)則被認(rèn)為是癌癥發(fā)生過程中的早期事件，其致癌機(jī)制主要包括促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制凋亡、增加腫瘤細(xì)胞侵襲力及促進(jìn)腫瘤血管生成。研究顯示，COX-2抑制劑可抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長，與許多抗腫瘤藥物具有協(xié)同抗腫瘤作用〔8〕。本研究中，COX-2抑制劑celecoxib能顯著抑制結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞的增殖，這種抑制作用具有濃度和時(shí)間依賴性。

將表達(dá)COX-2大腸癌細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)，可誘導(dǎo)大腸癌細(xì)胞產(chǎn)生的VEGF以旁分泌的形式作用于內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移及管樣結(jié)構(gòu)的形成，同時(shí)這一過程可被選擇性COX-2抑制劑及VEGF抗體抑制。本研究結(jié)果說明COX-2與腫瘤中的VEGF表達(dá)密切相關(guān)。雖然許多研究證實(shí)了它們之間存在調(diào)節(jié)關(guān)系，但具體機(jī)制卻依然不清楚〔9〕。本研究表明celecoxib可通過下調(diào)Sp1和Sp4蛋白以降低結(jié)腸癌細(xì)胞中的VEGF的表達(dá)水平，從而起到抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的作用。

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〔2014-11-07修回〕

(編輯杜娟)

〔文章編號〕1005-9202(2015)20-5721-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2015. 20. 017

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔中圖分類號〕R574. 6

第一作者:韓冰(1975-)，女，主治醫(yī)師，主要從事胃腸病研究。