趙　蕊　張　濤蔡亞平　邵星月陳志寶　阮洪生　葛文中　鄭小亮(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命學(xué)院，黑龍江　大慶　6339)

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枸杞多糖膠囊對小鼠急性毒性的影響

趙蕊張濤1蔡亞平邵星月2陳志寶阮洪生葛文中鄭小亮
(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命學(xué)院，黑龍江大慶163319)

〔摘要〕目的觀察小鼠口服枸杞多糖膠囊的毒性反應(yīng)。方法采用一次最大限量法給藥測定小鼠口服枸杞多糖膠囊的急性毒性;以枸杞多糖膠囊高劑量組(10 g·kg－1·d－1)、中劑量組(5 g·kg－1·d－1)、低劑量組(2. 5 g·kg－1·d－1)，灌胃小鼠，連續(xù)24 w，觀察小鼠的體重、血液學(xué)、血液生化學(xué)、組織病理指標(biāo)的變化。小鼠骨髓細胞微核試驗及小鼠精子畸形試驗對枸杞多糖膠囊進行安全性評價。結(jié)果枸杞多糖膠囊最大給藥濃度20g/kg時，小鼠未見毒性反應(yīng)。各給藥組小鼠體重與對照組比較，無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0. 05)。不同劑量的枸杞多糖膠囊對小鼠血液學(xué)、生化學(xué)指標(biāo)、臟器形態(tài)學(xué)、小鼠骨髓細胞微核率及小鼠精子畸形率的影響均未見異常。結(jié)論枸杞多糖膠囊無毒且未見遺傳毒性作用。

〔關(guān)鍵詞〕枸杞多膠囊;毒性

1佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院2大慶油田總醫(yī)院

第一作者:趙蕊(1975-)，女，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事中藥藥理毒理學(xué)研究。

枸杞多糖具有增強機體免疫功能、抗腫瘤、抗腎衰老等作用〔1～3〕。實驗證明，枸杞多糖能有效治療二型糖尿病并確定其機制〔4～6〕。本研究制備枸杞有效成分多糖，并制成膠囊研究其毒理學(xué)。

1　材料與方法

1. 1材料昆明種小鼠，18～22 g，雌雄各半。枸杞多糖膠囊，由本實驗室提供，實驗前將膠囊內(nèi)藥粉用蒸餾水配制成各劑量組灌胃所需濃度的懸浮液。儀器:日立7020全自動生化分析儀(日本); SWELABAC920EO自動血球計數(shù)儀(瑞典)。

1. 2方法

1. 2. 1小鼠口服急性毒性實驗由于預(yù)實驗測不出LD50，故采用一次最大限量法，清潔級健康昆明小鼠40只，雌、雄各半，小鼠觀察30 d，適應(yīng)實驗環(huán)境。禁食不禁水12 h后，隨機挑選20只(雌、雄各半)按20 g/kg，0. 4 ml/10 g經(jīng)口一次給藥，另20只給予同體積的蒸餾水，連續(xù)觀察7 d，記錄小鼠的中毒癥狀及死亡情況。

1. 2. 2小鼠長期毒性實驗實驗前將小鼠觀察1 w，適應(yīng)實驗環(huán)境。隨機分為四組，空白對照組、枸杞多糖膠囊高劑量組(10 g·kg－1·d－1)、中劑量組(5 g·kg－1·d－1)、低劑量組(2. 5 g·kg－1·d－1)，每組30只，雌雄各半。每天灌胃給藥10 ml/kg，空白對照組灌服等體積生理鹽水，連續(xù)灌胃24 w。給藥前及給藥期間每周稱動物體重1次，并根據(jù)體重變化調(diào)整給藥體積。觀察指標(biāo):①一般情況:給藥期間每天定時觀察小鼠外觀體征、行為活動和糞便情況，并作記錄;每2 w測定體重1次，直至給藥結(jié)束;②血液學(xué)檢查:白細胞數(shù)(WBC)、淋巴細胞數(shù)(LYM)、紅細胞數(shù)(RBC)、粒細胞數(shù)(GRAN)、血紅蛋白(HGB)、血小板(PLT);③血液生化檢查:在停藥后斷頭取血測定血液生化指標(biāo)，包括血清肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、總膽紅素(TBIL)、總蛋白(TP)和白蛋白(ALB)的含量;④重要器官病理學(xué)檢查:給藥結(jié)束時對實驗小鼠進行解剖檢查，肉眼觀察各主要臟器大小、顏色、硬度、表面光滑情況及胸腔有無積液;取肝和腎，用10%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋后切片，HE染色鏡檢，觀察有無萎縮、變性、壞死、炎細胞浸潤、變質(zhì)、滲出和增生等病理學(xué)變化。

1. 2. 3小鼠骨髓微核試驗雌、雄昆明種小鼠各35只，隨機分為五組。各分為空白組、陽性藥組(0. 04 g/kg，環(huán)磷酰胺)、枸杞多糖膠囊高劑量組(10 g·kg－1·d－1)、中劑量組(5 g·kg－1·d－1)、低劑量組(2. 5 g·kg－1·d－1)。灌胃給藥，灌胃量0. 4 ml/20 g，初次給藥后，間隔24 h給藥，末次給藥后6 h處死動物。解剖小鼠股骨，用小牛血清沖洗骨髓腔，制成細胞混懸液涂片，自然干燥。涂片甲醇固定5 min，Giemsa應(yīng)用液染色15 min，用磷酸緩沖液沖洗涂片，自然干燥后閱片。

1. 2. 4小鼠精子畸形試驗雄性昆明種小鼠25只，分組及給藥同1. 2. 2，其中空白組給予0. 5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)。連續(xù)給藥五天，第35天處死動物，解剖出小鼠兩側(cè)附睪置于2 ml生理鹽水中，縱剪1～2刀，輕搖，靜置5 min。四層擦鏡紙濾過，濾液涂片，自然干燥。涂片甲醇中固定5 min，自然干燥后2%伊紅染色1 h，蒸餾水清洗涂片。自然干燥后閱片。

1. 3統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS11. 0統(tǒng)計軟件行單因素方差分析及χ2檢驗。

2　結(jié)果

2. 1小鼠急性毒性實驗結(jié)果連續(xù)觀察7 d，小鼠無死亡現(xiàn)象，小鼠給藥后無不安等異常反應(yīng)，運動協(xié)調(diào)，分泌物無增多現(xiàn)象，皮毛干凈整潔。解剖觀察小鼠各臟器重量質(zhì)地顏色均無異常。表明枸杞多糖膠囊對雌、雄小鼠基本安全無毒。

2. 2小鼠長期毒性實驗結(jié)果給藥24 w后，小鼠無死亡。各組小鼠的自主活動、飲水、攝食、排泄等均未見異常。各給藥組小鼠體重分別與空白對照組體重比較，均無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0. 05)。見表1。各給藥組小鼠血液學(xué)、生化學(xué)指標(biāo)與空白對照組比較，差異不顯著(P＞0. 05)，并且均在正常值范圍。見表2，表3。肉眼觀察心、肝、脾、肺和腎等主要臟器，未見組織有異常改變。病理組織學(xué)檢查小鼠肝和腎發(fā)現(xiàn)小部分肝、腎細胞水腫，空白組和枸杞膠囊各組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明枸杞膠囊沒有明顯毒性作用，可能由于動物自身或其他原因所致。

2. 3枸杞多糖膠囊對肝、腎組織影響各組小鼠肝臟小葉結(jié)構(gòu)清楚，細胞形態(tài)正常，未見明顯變性及壞死(圖1);各組小鼠腎臟皮質(zhì)髓質(zhì)界限清楚，腎小球清晰可見，髓質(zhì)及乳頭部未見明顯改變(圖2)。

2. 4枸杞多糖膠囊對小鼠精子畸形率的影響陽性藥組小鼠的精子畸形率與空白組小鼠相比有極顯著差異。三個劑量組的枸杞多糖膠囊與空白組相比無顯著差異。不同劑量的枸杞多糖膠囊，對小鼠精子畸形率的影響無顯著差異。見表4。

表1　枸杞多糖膠囊對長期毒性實驗小鼠體重的影響(x ±s，n=30，g)

表2　枸杞多糖膠囊對長期毒性實驗小鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響(x±s，n=30)

表3　枸杞多糖膠囊對長期毒性實驗小鼠生化學(xué)指標(biāo)的影響(x±s，n=30)

圖1　枸杞多糖膠囊對肝組織影響(HE，×200)

2. 5枸杞多糖對小鼠骨髓細胞微核率的影響陽性藥組與空白組有顯著差異(P＜0. 01)。枸杞多糖膠囊各劑量組與空白組相比，無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0. 05)。不同劑量的枸杞多糖膠囊對小鼠微核率的影響無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0. 05)。見表5。

表4　枸杞多糖膠囊對小鼠精子畸形率的影響(x ±s，n=7)

表5　枸杞多糖膠囊對小鼠骨髓細胞微核率的影響(x±s，n=7)

圖2　枸杞多糖膠囊對腎組織影響(HE，×200)

3　討論

急性毒性研究表明，在枸杞多糖膠囊的最大給藥濃度20 g/kg時，小鼠未見毒性反應(yīng)，說明小鼠的最大耐受量＞20 g/kg，為實際無毒物質(zhì)。本實驗結(jié)果說明枸杞多糖膠囊對動物血液和主要代謝排泄器官無明顯毒性。微核是在有絲分裂后期，沒有進入子細胞細胞核的單染色體或染色體片段形成的。小鼠微核率的提高，提示染色體受到染色體斷裂劑或紡錘體毒物作用的影響。本研究中，枸杞多糖膠囊組雌、雄性小鼠的微核率與空白對照組無顯著性差異。枸杞多糖膠囊對小鼠微核率的影響與性別無關(guān)聯(lián)性，提示枸杞多糖膠囊對哺乳動物體細胞畸變率無影響。哺乳動物精子的形態(tài)受基因的控制，精子形態(tài)發(fā)生改變提示哺乳動物可能受到外界致突變作用的影響。正常情況下，哺乳動物也有一定的自發(fā)精子畸形率，但在受到外界致畸條件影響時，就會引起精子畸形率的大幅度提高。本研究提示，枸杞多糖無致小鼠精子畸形作用，與微核試驗的結(jié)果一致。綜上，根據(jù)《保健食品安全性毒理學(xué)評價規(guī)范》的要求，經(jīng)過第一階段急性毒性研究和第二階段的遺傳毒性研究，表明枸杞多糖膠囊屬實際無毒物質(zhì)，對哺乳動物無遺傳毒性，臨床應(yīng)用安全。

4參考文獻

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〔2014-09-19修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)

基金項目:大慶高新區(qū)科技專項資金項目(DQGX2011kj035)

〔文章編號〕1005-9202(2015)20-5714-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2015. 20. 014

〔文獻標(biāo)識碼〕A

〔中圖分類號〕R283. 6