王緒?！堈衽d宋曉峰　李樹玲　周青青　(遼寧醫(yī)學(xué)院，遼寧　錦州　200)

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JAK2-STAT3信號通路在大鼠腦出血模型中的作用

王緒常張振興1宋曉峰李樹玲周青青(遼寧醫(yī)學(xué)院，遼寧錦州121001)

〔摘要〕目的探討大鼠腦出血后JAK2-STAT3信號通路的作用機制及與腦水腫的關(guān)系。方法健康雄性SD大鼠108只，經(jīng)尾動脈取血緩慢注射到尾狀核區(qū)制作大鼠腦出血模型。根據(jù)出血時間不同，采用隨機數(shù)字表法將其分為3 h、9 h、1 d、3 d、5 d和7 d 6組，每個組又分為3個亞組:模型組、假手術(shù)組和AG490組。采用免疫組織化學(xué)和Western印跡檢測JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3的表達(dá)，并測定腦組織含水量。結(jié)果與假手術(shù)組和AG490組相比，模型組中p-JAK2和p-STAT3大量表達(dá)，并于24 h時達(dá)到高峰;與模型組相比，AG490組大鼠腦組織含水量在各時間點均較低。結(jié)論腦出血后能夠激活JAK2-STAT3信號通路，并導(dǎo)致腦組織水腫。

〔關(guān)鍵詞〕JAK2; STAT3;腦出血

1遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院

第一作者:王緒常(1988-)，男，在讀碩士，主要從事腦血管疾病的基礎(chǔ)和臨床研究。

JAK2-STAT3信號通路是近年新發(fā)現(xiàn)的一條細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，與抑制炎性反應(yīng)、腫瘤、神經(jīng)病理性疼痛、神經(jīng)退行性變及腦缺血等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理生理過程密切相關(guān)〔1～5〕。但該系統(tǒng)在腦出血中表達(dá)變化尚未明確。本實驗通過制作腦出血模型初步了解JAK2/STAT3信號通路的動態(tài)變化，探討其作用機制。

1　材料與方法

1. 1材料JAK2抗體，p-JAK2抗體，STAT3抗體，p-STAT3抗體，二抗(Santa Cruz公司); DW-2000立體定向儀(成都泰盟科技有限公司);微量進樣器(上海高鴿工貿(mào)有限公司);鉆孔機(鄭州市一美牙科工業(yè)有限公司);電子天平(Denver Instrument Company A-200型，DS美國);切片機;電泳系統(tǒng)(北京六一公司);手術(shù)器械包;消毒液?等。

1. 2方法

1. 2. 1實驗動物與分組健康雄性SD大鼠108只，體質(zhì)量250～300 g，許可證號: SCXK(遼)2010-0001，由遼寧長生生物技術(shù)有限公司提供。室溫25℃左右，正常飼料喂養(yǎng)，自由攝水和食物，每日更換墊料。根據(jù)出血時間的不同，按照隨機數(shù)字表法分為6組(n=18): 3、9 h、1、3、5、7 d組。每組中又按照隨機數(shù)字表法隨機分為3個亞組:①模型組(M組);②假手術(shù)組(S 組);③AG490組(AG組)，每組6只。每組中3只用來做免疫組化檢測，3只用來做蛋白印跡檢測。M組:刺破尾動脈取得動脈血，緩慢注射到尾狀核區(qū)制作出腦出血模型。S組:除了腦內(nèi)不注入動脈血液外，其他操作與模型組相同。AG組:造模前10 min靜脈注射JAK2特異性抑制劑AG490(3 mg/kg)。處死大鼠后取得腦組織標(biāo)本，測量其含水量;應(yīng)用免疫組織化學(xué)和Western印跡方法檢測JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3蛋白表達(dá)。

1. 2. 2大鼠腦出血模型的制作10%水合氯醛300 mg/kg腹腔麻醉，俯臥位固定在成都泰盟DW-2000立體定向儀上，使門齒鉤平面比耳間線平面低2. 4 mm〔6〕。剪去頭部背側(cè)鼠毛，皮膚消毒，正中切開皮膚，長約15 mm，3%雙氧水腐蝕骨膜(用刀片刮去骨膜)，暴露前后囟門及冠狀縫，于冠狀縫前0. 2 mm，中線右側(cè)旁開3 mm處鉆一直徑約1 mm的小孔，不傷及硬腦膜〔7〕。將大鼠腹部翻轉(zhuǎn)，于鼠尾根部腹側(cè)正中消毒后做一2～3 mm切口，使用玻璃分針擴大至1 cm切口，分離暴露尾動脈并剪斷，待血液流出后，棄去第一滴血液，用微量進樣器吸取60 μl血液，將其固定于立體定向儀上，調(diào)整滑桿，沿鉆孔方向垂直進針，深度6 mm為注射點(尾狀核)。先緩慢注射10 μl，停針約2 min(此期間可加壓包扎好尾動脈)，然后緩慢勻速(10～17 μl/min，針芯旋轉(zhuǎn)推注)注射剩余血液，注射時間約3～5 min，注射后留針20 min，骨蠟封住顱孔，縫合皮膚切口并消毒，預(yù)防局部感染。

1. 2. 3大鼠神經(jīng)學(xué)評分〔8〕神經(jīng)癥狀觀察參照Longa 5級評分法，在大鼠處死前進行神經(jīng)功能缺損評分。

1. 2. 4標(biāo)本的采集各組大鼠在3、9 h、1、3、5、7 d相應(yīng)時間點處死。處死前經(jīng)腹注射10%水合氯醛。待麻醉后，將大鼠固定在實驗架上，迅速開胸，充分暴露出心臟，經(jīng)左心室插入吊針針頭至升主動脈;右心耳處剪一缺口，將250 ml生理鹽水進行全速灌注，再用4%多聚甲醛250 ml進行灌注，待肝脾發(fā)硬，立即斷頭取腦。取得標(biāo)本處理后繼續(xù)于4%多聚甲醛中固定24 h，脫水、包埋，連續(xù)冠狀位切片，恒溫切片機連續(xù)切片，片厚5 μm，行免疫組化檢測; JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3染色結(jié)果的判定使用二級計分法計數(shù)陽性細(xì)胞，在裝有目鏡網(wǎng)格測微尺的光學(xué)顯微鏡200倍視野下隨機選取5個視野，計數(shù)500個細(xì)胞，根據(jù)陽性細(xì)胞比例及陽性著色強度，按Shimizu等〔9〕采用的評分標(biāo)準(zhǔn)進行:以陽性細(xì)胞數(shù)＜5%、5%～24%、25%～50%、51%～74%及≥75%，分別判定為0、1、2、3、4分;每張切片陽性細(xì)胞的著色強度按無著色、淡黃色、棕黃色和棕褐色分別判定為0、1、2、3分;根據(jù)兩項積分之和判定結(jié)果，0分為陰性(－)，1分～2分為弱陽性(+)，3分～5分為中等陽性()，6分～7分為強陽性()。3只用來做Western印跡檢測，大鼠直接處死，迅速斷頭取腦，留取右側(cè)損傷腦組織，放入－80℃冰箱中凍存。

1. 2. 5腦組織含水量的測定取右側(cè)大腦進針處前、后0. 6 cm的腦組織，使用濾紙吸盡其表面水分，置于錫箔紙上，放在電子天平上秤出濕重，置入110℃恒溫烘箱內(nèi)烤48 h后秤其干重，計算腦組織的含水量:大鼠腦組織含水量=(大鼠腦組織濕重－大鼠腦組織干重)/大鼠腦組織濕重×100%。

1. 2. 6 Western印跡檢測組織塊破碎后(冰上操作)，加入RIPA裂解液勻漿處理，煮沸變性留取上清液待用。配制8%分離膠和4%濃縮膠，取樣品上樣，進行SDS-PAGE電泳。恒流0. 11～0. 2A，轉(zhuǎn)移2～4 h，電轉(zhuǎn)完成后，將PVDF膜上含有蛋白Marker的條帶切下，于麗春紅S染液中進行反應(yīng)，10～20 min，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h?？贵w4℃過夜。棄掉第一抗體溶液，TBST漂洗轉(zhuǎn)印膜，15 min×4次，加入二抗，作用1 h。免疫反應(yīng)條帶用化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)進行檢測，測定磷酸化JAK2、STAT3和總JAK2、STAT3蛋白的表達(dá)水平，X線進行照相記錄，β-actin作為內(nèi)參照。用Quantity One軟件測蛋白條帶積分灰度值，以各組蛋白表達(dá)量與β-actin內(nèi)參照的比值進行半定量分析。

1. 3統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS16. 0軟件進行方差分析、單因素方差分析。

2　結(jié)果

2. 1大鼠腦組織含水量S組中大鼠右側(cè)腦組織標(biāo)本含水量為(71. 15±0. 02)%;與S組相比，M組中大鼠右側(cè)腦組織標(biāo)本含水量明顯增高(P＜0. 05)，3 d時達(dá)到高峰，直到7 d含水量仍然較高(P＞0. 05);與M組相比，AG組中大鼠右側(cè)腦組織標(biāo)本中含水量明顯減少(P＜0. 05)(表1)。

表1　各組大鼠中腦組織標(biāo)本含水量測定結(jié)果(%，x±s，n=6)

2. 2免疫組織化學(xué)檢測各組中JAK2、STAT3蛋白均為陽性表達(dá)，表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中(圖1、圖2)，陽性細(xì)胞計數(shù)的差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0. 05); S組和AG組中p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)為陰性或弱陽性; M組中p-JAK2、p-STAT3蛋白為陽性表達(dá)，p-JAK2主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，p-STAT3主要表達(dá)于細(xì)胞核，胞質(zhì)少量表達(dá)(圖3)，且p-JAK2和p-STAT3蛋白在24 h呈強陽性表達(dá)，陽性細(xì)胞計數(shù)最多(圖4)。

圖1　大鼠JAK2免疫組化結(jié)果

圖2　大鼠STAT3免疫組化結(jié)果

圖3　大鼠p-JAK2和p-STAT3免疫組化結(jié)果(×400)

圖4　 24 h p-JAK2和p-STAT3免疫組化結(jié)果(×200)

2. 3 Western印跡檢測S組、AG組和M組JAK2蛋白水平相當(dāng)(圖5);并且隨著時間的推移，其表達(dá)量也較恒定。S組、AG組和M組STAT3蛋白水平相當(dāng)(圖6)，且表達(dá)量隨時間推移變化不顯著。

S組和AG組中大鼠腦組織p-JAK2和p-STAT3均表達(dá)為陰性，M組p-JAK2蛋白呈陽性表達(dá)，于1 d后蛋白表達(dá)量最大，與p-STAT3蛋白表達(dá)量存在一致性(圖7，表2)。

表2　 M組大鼠腦組織p-JAK2、p-STAT3表達(dá)水平比較(x±s)

圖5　各組AG組中大鼠腦組織JAK2蛋白表達(dá)情況

圖6　各組大鼠腦組織STAT3蛋白表達(dá)情況

圖7　 M組大鼠腦組織p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)

3　討論

JAKs/STATs是近年來發(fā)現(xiàn)的由細(xì)胞外到細(xì)胞內(nèi)起作用的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，該通路包括JAK蛋白家族和STAT蛋白家族。JAK蛋白家族包括JAK1、JAK2、JAK3和Tyk2 4個成員，STAT蛋白家族成員在哺乳動物中已被克隆出的有以下7種: STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b和STAT6，并且JAK是STAT上游的共有激酶〔10〕。目前研究認(rèn)為該信號通路的作用途徑大致為:胞外可溶性信號分子(炎性因子、細(xì)胞因子、生長因子)能夠識別膜上的特異性受體，并與之結(jié)合，隨之信號分子與特異性受體結(jié)合發(fā)生二聚化，并能相互磷酸化，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)形成對JAKs蛋白具有高親和性的結(jié)合位點; JAKs蛋白與結(jié)合位點融合一起后，誘使酪氨酸磷酸化而活化，活化后的JAKs蛋白在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)募集信號分子并識別STATs家族蛋白中的SH2功能結(jié)構(gòu)域，誘使STAT蛋白磷酸化而活化;活化后的STATs家族蛋白之間可彼此形成同源或異源性二聚體并定向移動到細(xì)胞核內(nèi)，與靶基因上游的啟動子相結(jié)合，進而直接激活靶基因，使其得以活化而表達(dá)，完成特異性信號分子受體介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)過程，表達(dá)相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)。目前已知有多種細(xì)胞因子(如IFN、IL-4、IL-6)和生長因子(如ECF、CSF、EPO)能夠通過活化JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來進行轉(zhuǎn)導(dǎo)，不同的受體亞家族可分別通過特定的JAK和STAT蛋白分子進行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，該途徑已成為信號分子完成信息轉(zhuǎn)導(dǎo)的一條重要通道〔11〕。已有研究表明氧化應(yīng)激反應(yīng)也能激活JAK-STAT信號通路〔12〕。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路不僅廣泛參與細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)、增殖分化、生長及凋亡，而且可能與炎癥、缺血等中樞神經(jīng)疾病緊密相關(guān)，更重要的是可參與介導(dǎo)多種病理過程中炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)的發(fā)生〔13〕。因此國內(nèi)外的研究學(xué)者對以此信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路作為靶途徑研究進而研發(fā)出新型的靶向治療方法產(chǎn)生了極其濃厚的興趣〔14，15〕。研究還發(fā)現(xiàn)，JAK2-STAT3通路是一條細(xì)胞因子對機體免疫反應(yīng)、神經(jīng)系統(tǒng)和胚胎組織發(fā)育的調(diào)節(jié)以及細(xì)胞分裂、分化和凋亡等具有多重效應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。那么JAK2/STAT3通路作為重要的細(xì)胞外到細(xì)胞內(nèi)信號分子起作用的傳導(dǎo)通路，廣泛參與了細(xì)胞應(yīng)激、分裂、生長、分化和調(diào)亡等多種生物學(xué)效應(yīng)，并可被細(xì)胞外多種因子(炎性因子、生長因子等)和環(huán)境應(yīng)激等激活，進而介導(dǎo)細(xì)胞分裂、分化以及增殖、凋亡等信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)。然而它是否參與調(diào)控腦出血后周圍組織損傷過程，而阻斷此信號通路又有何影響，如何發(fā)生變化，對這些問題國內(nèi)、外尚未見研究報道。

給予AG490干預(yù)后，大鼠腦組織含水量減少，提示腦水腫較輕，且p-JAK2和p-STAT3的表達(dá)也被抑制，對腦組織應(yīng)有一定保護作用?？赡苁怯捎贏G490抑制劑阻斷了JAK2-STAT3這一信號通路后所起的作用，據(jù)此可以推測JAK2-STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了腦出血后周圍組織的損傷過程，并導(dǎo)致腦組織水腫。AG490作為一種JAK2特異性抑制劑，在很多研究實驗中都被應(yīng)用。已有研究表明，在應(yīng)用AG490這種JAK2抑制劑后，能明顯抑制腦組織損傷后p-JAK2、p-STAT3蛋白的表達(dá)，減輕大腦神經(jīng)細(xì)胞損傷，改善神經(jīng)組織功能缺損〔16〕，并與鄧必高等〔17〕研究結(jié)果相一致。p-JAK2和p-STAT3表達(dá)水平的降低，能減輕腦水腫，在一定程度上發(fā)揮腦保護作用。

本實驗結(jié)果顯示大鼠腦出血后周圍損傷腦組織中p-JAK2、p-STAT3表達(dá)含量隨時間推移逐漸增多，提示可能是由于應(yīng)激或內(nèi)環(huán)境的變化導(dǎo)致了JAK2-STAT3信號通路的激活，進而參與腦出血后周圍組織損傷的病理生理變化。由于應(yīng)用JAK2蛋白抑制劑后，腦組織水腫有所減輕，并且p-JAK2和p-STAT3蛋白含量減少，提示可能是由于JAK2和STAT3的磷酸化引發(fā)腦組織水腫，但具體作用機制尚不清楚，有待于進一步研究。

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〔2015-07-27修回〕

(編輯曲莉)

The mechanisms of JAK2-STAT3 signaling pathway in intracerebral hemorrhage models of rats

WANG Xu-Chang，ZHANG Zhen-Xing，SONG Xiao-Feng，et al．
Liaoning Medical University，Jinzhou 121001，Liaoning，China

【Abstract】Objective To investigate the role and mechanisms of JAK2-STAT3 signaling pathway preliminarily in intracerebral hemorrhage rat model and the relationship between brain edema．Methods 108 healthy male SD rats were used to induce intracerebral hemorrhage models．According to the difference of bleeding time，all rats were randomly divided into six groups．Every group was further divided into three subgroups: model(M)，sham(S)and AG490(AG)groups．Both immunohistochemistry and Western blot analysis were used to detect the expressions of JAK2，p-JAK2，STAT3 and p-STAT3．Results Compared with those of sham and AG groups，the protein levels of p-JAK2 and p-STAT3 were significantly increased in M group and peaked at 24 h．Compared with that of model group，the water content of rat brain tissues in AG group were lower than that in M group at every time point．Conclusions The JAK2-STAT3 signaling pathway could be activated in intracerebral hemorrhage rat model and contributes to brain edema．

【Key words】JAK2; STAT3; Intracerebral hemorrhage

通訊作者:張振興(1974-)，男，博士，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事腦血管疾病的基礎(chǔ)和臨床研究。

基金項目:遼寧省高等學(xué)校杰出青年學(xué)者成長計劃(No．LJQ2013088)

〔文章編號〕1005-9202(2015)20-5708-04;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2015. 20. 012

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔中圖分類號〕R743. 34